人的類RecD解旋酶Pif1通過抑制端粒酶活性調(diào)控端粒延伸.pdf

1、端粒是真核生物線狀染色體的末端結(jié)構(gòu)，由端粒DNA和其結(jié)合蛋白組成。它在維持基因組的穩(wěn)定、防止染色體DNA末端融合和降解中起著重要的作用，并與癌癥、衰老密切相關(guān)。端粒DNA重復(fù)序列的延伸是由特化的反轉(zhuǎn)錄酶即端粒酶完成的。端粒酶的核心組分是由具有催化活性的蛋白質(zhì)亞基(hTERT)和RNA亞基(hTR)組成，hTR為合成端粒DNA重復(fù)序列提供模板。 以前的研究發(fā)現(xiàn)芽殖酵母Pif1解旋酶通過抑制端粒酶途徑來抑制端粒DNA的加長。端粒D

2、NA復(fù)制的基本機制從酵母到人都高度保守，而類Pif1基因在多種生物中都廣泛存在。因而，本研究的主要目的是鑒定人Pif1蛋白，是否也參與了端粒DNA的復(fù)制和維持。本工作首先克隆了人Pif1的cDNA。一級結(jié)構(gòu)及生化分析表明，人Pif1蛋白是大腸桿菌RecD潛在的同源蛋白；具有依賴于ATP的5'至3'的DNA解旋酶活性。在端粒酶陽性的HT1080細胞中過表達野生型hPif1蛋白可導(dǎo)致細胞端粒DNA縮短，抑制hPif1過表達可使端粒DNA長度

3、恢復(fù)。人Pif1對端粒DNA長度的影響需要其ATPase/解旋酶活性，因為喪失ATPase/解旋酶活性的突變體過表達不影響端粒DNA的長度。在端粒酶陰性的GM487細胞中過表達hPif1不影響端粒變化，提示hPif1蛋白對端粒DNA的效應(yīng)是通過端粒酶通路介導(dǎo)的。體外生化實驗還顯示，重組Pif1蛋白可通過降低端粒酶的進行性從而直接抑制端粒酶的活性，而且，hPif1解旋酶能夠解開DNA/RNA雜合雙螺旋。染色質(zhì)免疫沉淀還證實hPif1結(jié)合在