天然無內(nèi)含子mRNA轉(zhuǎn)運(yùn)出核順式作用元件的預(yù)測(cè)與功能鑒定.pdf

1、背景：mRNA轉(zhuǎn)運(yùn)出核一直是RNA領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)與難點(diǎn)，近些年的研究中發(fā)現(xiàn)mRNA中存在調(diào)控其轉(zhuǎn)運(yùn)出核的順式作用元件[1]。在高等生物中，出核轉(zhuǎn)運(yùn)與剪接過程是關(guān)聯(lián)十分密切的。在mRNA發(fā)生剪接過程時(shí)，剪接復(fù)合體會(huì)直接招募出核轉(zhuǎn)運(yùn)復(fù)合體并共同完成剪接與出核兩種生命活動(dòng)[2-5]。刪除基因的內(nèi)含子后，mRNA會(huì)因?yàn)榧艚邮录慕K止而被阻滯在細(xì)胞核內(nèi)[6]。所以在剪接與轉(zhuǎn)運(yùn)出核相偶聯(lián)的mRNA中，內(nèi)含子就成為轉(zhuǎn)運(yùn)出核的順式作用元件[7]。天然無

2、內(nèi)含子mRNA占全部mRNA的5%，其中包含著像干擾素、組蛋白等對(duì)生物體的生命過程非常重要的基因[8]。天然無內(nèi)含子mRNA其本身因不具有內(nèi)含子而不會(huì)發(fā)生剪接過程，那么這些天然無內(nèi)含子的mRNA是否同樣存在轉(zhuǎn)運(yùn)出核的順式作用元件呢？本實(shí)驗(yàn)室在之前對(duì)4個(gè)天然無內(nèi)含子mRNA（HSPB3、IFNα1、IFNβ1,、c-Jun）的研究中，發(fā)現(xiàn)4條mRNA中的保守序列CAR-E（促細(xì)胞質(zhì)區(qū)域聚集元件）能夠促進(jìn)已阻滯在細(xì)胞核內(nèi)的β-球蛋白cDNA

3、轉(zhuǎn)運(yùn)出核[9]。那么在更大范圍的天然無內(nèi)含子mRNA中是否同樣存在這樣功能的順式作用元件？這些順式作用元件的結(jié)合蛋白是什么？目前的研究依然沒有解決這些問題。本文通過對(duì)天然無內(nèi)含子mRNA轉(zhuǎn)運(yùn)出核機(jī)制的研究完善mRNA轉(zhuǎn)運(yùn)出核機(jī)制。
　　方法：1.通過生物信息學(xué)比對(duì)軟件MEME對(duì)天然無內(nèi)含子的mRNA數(shù)據(jù)庫（Intronless Gene Database）進(jìn)行比對(duì)，檢索其中存在的共有片段。2.將獲取的共有片段與已驗(yàn)證阻滯在細(xì)胞核內(nèi)

4、的β-球蛋白的cDNA進(jìn)行重組連接，通過原位熒光雜交技術(shù)（FISH）尋找可以促進(jìn)cDNA發(fā)生出核轉(zhuǎn)運(yùn)的片段。3.通過生物信息學(xué)軟件FIMO對(duì)天然無內(nèi)含子mRNA數(shù)據(jù)庫進(jìn)行反檢索，找到含有促進(jìn)cDNA出核序列的天然無內(nèi)含子mRNA，并對(duì)其中預(yù)測(cè)的順式作用元件進(jìn)行堿基刪除、突變，檢測(cè)其在天然無內(nèi)含子mRNA中是否具有促進(jìn)出核的功能。4.構(gòu)建預(yù)測(cè)元件、β-球蛋白cDNA與pCDNA5載體的重組質(zhì)粒。利用Flp-In系統(tǒng)在FRT-Hela細(xì)胞中

5、構(gòu)建穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞株。并通過MS2-MBP蛋白純化體系與質(zhì)譜分析方法確定順式作用元件的結(jié)合蛋白[10]。
　　結(jié)果：通過生物信息學(xué)軟件MEME將679個(gè)天然無內(nèi)含子mRNA數(shù)據(jù)進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)其中含有多條共有序列。FISH實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示在預(yù)測(cè)的順式作用元件中有4條能夠促進(jìn)β-球蛋白cDNA的mRNA出核轉(zhuǎn)運(yùn)，我們分別命名為motif1-AS、motif1V-AS、motif4-AS、motif5。天然無內(nèi)含子mRNA KRN1基因中含有9個(gè)

6、預(yù)測(cè)元件motif1V-AS，其中6個(gè)元件位置相近我們將這6個(gè)元件整體命名為CAR-C。通過分子克隆的方法將CAR-C進(jìn)行刪除與突變，F(xiàn)ISH實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示刪除與突變后的KRN1 mRNA會(huì)被阻滯在細(xì)胞核內(nèi)。完成穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞構(gòu)建后我們通過MS2-MBP蛋白結(jié)合體系，得到預(yù)測(cè)元件的結(jié)合蛋白，并通過聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE）后的銀染實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)促出核元件結(jié)合蛋白與非促出核元件結(jié)合蛋白存在特異性條帶。
　　結(jié)論：實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)表明預(yù)測(cè)中具有促進(jìn)β-