小鼠卵巢氧化應激模型建立以及卵巢保護性抗氧化劑的篩選.pdf

1、隨著生活節(jié)奏的日益加快，社會競爭的日益激烈，無論是學習還是工作都處于緊張狀態(tài)，過度的緊張和焦慮導致現(xiàn)代職業(yè)女性的心理壓力越來越大，生殖系統(tǒng)疾病的發(fā)病率越來越多，卵巢氧化應激引起的人類生殖疾病也日益升高。卵巢氧化應激不僅影響著卵子的生成、卵泡的發(fā)育、卵子的成熟、卵泡的閉鎖和排卵等，還能降低卵母細胞和胚胎的質(zhì)量以及影響早期胚胎的發(fā)育能力，這些都會使受精率、胚胎質(zhì)量、妊娠率顯著降低。由于倫理和道德等原因，很難在人類對卵巢氧化應激的發(fā)生、發(fā)展和

2、治療進行深入細致的研究。因此建立成功可靠的動物卵巢氧化應激模型，用于揭示卵巢氧化應激機制以及開發(fā)研究新型抗卵巢氧化應激藥物具有重要的實際意義。本研究應用氧化劑3-NPA成功建立了小鼠卵巢氧化應激模型，并對此模型進行了評估。利用建立的小鼠卵巢氧化應激模型，研究比較了10種不同抗氧化劑對卵巢氧化應激的保護作用，共篩選出了4種效果顯著的卵巢保護性抗氧化劑，這對于研究卵巢氧化應激機制以及研究抗卵巢氧化應激藥物的作用機制有著重要意義。
　　

3、1、利用3-NPA建立小鼠卵巢氧化應激模型的研究
　　本試驗通過觀察ICR雌性小鼠體內(nèi)注射不同濃度氧化劑3-NPA(6.25，12.5和25mg/kg)后，卵巢組織中ROS水平，抗氧化酶活性、各級卵泡數(shù)量、排卵數(shù)及早期胚胎發(fā)育等指標來判斷卵巢氧化損傷的情況。結(jié)果表明，與對照組相比較，小鼠腹腔內(nèi)注射3-NPA(12.5mg/kg)連續(xù)7天，不僅能顯著提高小鼠大卵泡閉鎖比例，降低卵巢重量和大卵泡數(shù)量(P＜0.05)，還能顯著降低小鼠排

4、卵數(shù)量和早期胚胎發(fā)育能力(P＜0.05)。除上述指標外，3-NPA(12.5mg/kg)還能顯著降低顆粒細胞中Bcl-2/Bax的比值，提高(SOD2、CAT、GPX)mRNA的表達和ROS的水平（P＜0.05）。結(jié)果表明，小鼠腹腔內(nèi)注射3-NPA(12.5mg/kg)連續(xù)7天，可誘導卵巢顆粒細胞凋亡，大卵泡閉鎖和提高卵巢中ROS的水平。3-NPA所誘導的小鼠卵巢氧化應激的損傷可作為卵巢氧化應激的動物模型。
　　2、卵巢氧化應激保

5、護性抗氧化劑的篩選
　　本研究通過使用所建立的小鼠卵巢氧化應激模型，研究比較了不同抗氧化劑對體內(nèi)卵巢氧化應激的抗氧化保護作用。通過對10種不同抗氧化劑:VC、VE、胡蘿卜素、谷胱甘肽、沒食子酸、姜黃素、原花青素、白藜蘆醇、L-半胱氨酸和輔酶Q，抗氧化活性的檢測，我們將組織中的ROS水平和抗氧化物酶(SOD、CAT、GPX)的活性作為抗氧化功能的測定指標。結(jié)果表明，L-半胱氨酸、沒食子酸、姜黃素、原花青素、白藜蘆醇和胡蘿卜素6種抗氧

6、化劑能夠顯著降低卵巢組織內(nèi)ROS的水平（P＜0.05）;其中姜黃素、原花青素、白藜蘆醇和胡蘿卜素4種抗氧化劑可顯著提高卵巢的重量（P＜0.05）。GSH、VE、L-半胱氨酸、沒食子酸、VC、輔酶Q、白藜蘆醇、胡蘿卜素8種抗氧化劑均可使卵巢組織中代償升高的GPX活性顯著下降（P＜0.05）。GSH、VE、L-半胱氨酸、姜黃素、VC、輔酶Q、白藜蘆醇、胡蘿卜素8種抗氧化劑均可使卵巢組織中代償升高的T-SOD明顯降低（P＜0.05）。GSH、

7、VE、原花青素、輔酶Q、胡蘿卜素5種抗氧化劑均能夠降低卵巢中代償升高的CAT活性（P＜0.05）。本研究表明，卵巢氧化應激能夠?qū)е侣殉步M織的過氧化損傷，從而促進卵巢相關(guān)疾病的發(fā)生，體內(nèi)補充抗氧化劑能夠顯著降低卵巢過氧化損傷和提高卵巢組織的抗氧化功能。
　　3、不同抗氧化劑體外抗氧化活性的比較研究
　　本研究以體外培養(yǎng)的小鼠卵巢顆粒細胞為研究對象，觀察不同抗氧化劑:原花青素(PC)、維生素C(VC)和N-乙酰半胱氨酸(NAC)

8、對3-NPA致小鼠卵泡顆粒細胞損傷的保護作用。本研究共分為5組:陰性對照組、3-NPA模型組、PC組（50μg、100μg、200μg/mL）、VC組（25μg、50μg、100μg/mL）和NAC組（25μg、50μg、100μg/mL）。采用體外培養(yǎng)的方法，建立3-NPA致小鼠顆粒細胞氧化損傷模型。觀察各組細胞的形態(tài)和結(jié)構(gòu);采用四甲基偶氮唑鹽(MTT)比色法檢測細胞存活率，化學比色法檢測細胞內(nèi)超氧化物歧化酶(SOD)活性;TUNEL

9、法檢測細胞凋亡率，RT-PCR法分析了抗應激基因和凋亡相關(guān)基因的表達情況。結(jié)果表明，高濃度的PC、VC、NAC均可減輕3-NPA誘導的顆粒細胞氧化損傷，與3-NPA組相比較，PC、VC、NAC組細胞存活率由53.7％分別上升到85.3％、63.8％和60.5％（P＜0.05）;細胞凋亡率由38.2％分別降低到13.4％、23.6％和25.8％（P＜0.05）;PC、VC、NAC組細胞內(nèi)SOD活性明顯降低(P＜0.05)，PC和VC組細胞

10、內(nèi)MDA含量顯著降低（P＜0.05）;PC、VC、NAC組細胞內(nèi)抗應激和凋亡相關(guān)基因的表達水平明顯降低(P＜0.05)。結(jié)論:PC和VC對3-NPA誘導的卵泡顆粒細胞的氧化損傷有顯著的保護作用，其機制可能與提高顆粒細胞的抗氧化能力以及降低凋亡率有關(guān)。
　　4、小鼠卵巢氧化應激對繁殖性能的影響
　　為了研究卵巢氧化應激對孕鼠胚胎發(fā)育的影響，本研究利用以建立的小鼠卵巢氧化應激模型為研究對象，在超數(shù)排卵處理后，雌雄小鼠合籠，于次日

11、早晨檢查陰道栓。孕鼠分別在孕齡7.5d、12.5d和18d頸椎脫臼處死，處死前分別稱重，然后剖腹取出子宮，分離出子宮內(nèi)胚胎，分別稱重，計數(shù)胚胎數(shù)量。結(jié)果表明，和對照組（生理鹽水）相比較，3-NPA誘導的卵巢氧化應激組顯著地降低了孕鼠體重和增重;提高了胚胎的死亡率;降低了胎仔數(shù)量和胎鼠重量。結(jié)論:小鼠卵巢氧化應激能夠顯著地降低受孕率和繁殖性能。
　　本研究利用氧化劑3-NPA成功地建立了小鼠卵巢氧化應激模型，并且具有卵巢氧化應激的典