產聚羥基丁酸(PHB)菌株的篩選鑒定及發(fā)酵工藝優(yōu)化.pdf

1、聚羥基丁酸是一種生物可降解的高分子材料，可應用于醫(yī)學、環(huán)境保護、農業(yè)等領域，其用途廣泛，具有廣闊的工業(yè)應用價值。本文研究了從化工廠污水中篩選出1株能夠以甘油作為碳源來合成PHB的菌株。首先采用16S rDNA基因序列分析，確定該菌株屬于假單胞菌科（Pseudomonadaceae）假單胞菌屬（Pseudomonas），然后依據與其相關的生理生化特性試驗，確定該菌為惡臭假單胞菌（Pseudomonas putida），并將其命名為PP25

2、。進行初步發(fā)酵試驗，結果表明該菌以2％甘油作為主要碳源時，PHB產量為2.456g/L。
　　本研究主要內容包括：⑴建立紫外分光光度法及高效液相色譜法測定假單胞菌胞內的PHB含量。在紫外分光光度法的建立中以超聲波破壁作為細胞破壁的預處理方法，考察了超聲時間、三氯甲烷的蒸發(fā)時間、水浴時間、硫酸用量等因素，確定最優(yōu)試驗條件。紫外分光光度法于1.0~3.5μg/mL內呈線性關系。采用該方法對樣品測定時的回收率是95.93%~104.79

3、%，相對標準偏差是1.13%~4.27%。高效液相色譜法采用Aminex HPX-87C分析柱，采用紫外檢測器對胞內的PHB進行分離測定。經過色譜條件優(yōu)化，最終確定5 mmol/L硫酸作為流動相，流速選擇0.7 mL/min，柱溫選擇50℃。采用高效液相色譜法檢測樣品時回收率是98.91%~101.97%，相對標準偏差是0.763%~2.014%。⑵研究了溫度、搖床轉速、初始 pH、接種量、裝液量、碳源、氮源、無機鹽、金屬離子等因素對P

4、P25生長及PHB積累的影響。然后依據Placket-Burman試驗，篩選對PP25菌株合成PHB有顯著影響的因素。結果表明：甘油，硫酸銨及初始pH3個因子對PP25菌株合成PHB有顯著的影響。利用最陡爬坡試驗及響應面分析法探究3個顯著因素對PP25菌株積累PHB的關系。結果表明：當甘油為26.892 g/L，(NH4)2SO4為3.043 g/L，初始pH為7.004時，聚羥基丁酸最大估計值為8.062 g/L。經過對模型驗證， P

5、HB實際合成為7.881 g/L，與理論產量相似，比優(yōu)化前提高了32.52%。最終確定最優(yōu)的條件為是甘油26.892 g/L，檸檬酸2 g/L，(NH4)2SO43.043 g/L，Na2HPO4·12H2O15 g/L， NaH2PO2·H2O4 g/L，F(xiàn)eSO4·7H2O0.4 g/L，MgSO4·7H2O1.2 g/L，初始pH7.004。⑶探究了通氣量、溫度、pH對PP25菌株在5 L發(fā)酵罐中積累PHB的影響。結果表明：通氣量

6、選擇1.2 vvm、溫度選擇28℃和pH選擇6.5時，菌體生物量為18.04 g/L， PHB產量為10.617 g/L。比優(yōu)化前分別提高了46.19%和78.95%。在此基礎上，進行不同時間段補加甘油及補加不同C/N比的復合碳氮源補料工藝研究，確定在發(fā)酵24 h后補加C/N比為5:1的復合碳氮源（甘油60 g，硫酸銨12 g）時，比只補加甘油時分別提高了19.42%和19.11%。⑷研究了珠磨時間、珠磨質量、氯仿提取時間、溫