高產(chǎn)聚-B-羥基丁酸菌株篩選及發(fā)酵提取工藝研究.pdf

1、聚-β-羥基丁酸(Poly-β-hydroxvbutyrate,PHB)是微生物在碳、氮等營養(yǎng)失衡的條件下合成的碳源與能源的高分子儲存物(分子量50000-1000000)。作為微生物合成的可降解材料,PHB除了具有與化學(xué)合成高分子相似的理化性質(zhì),還具有一般化學(xué)合成高分子所沒有的性質(zhì)如光學(xué)活性、低透氧性、抗紫外輻射、生物可降解性、生物相容性、壓電性和抗凝血性等,在工業(yè)、農(nóng)業(yè)、環(huán)保、食品、醫(yī)藥等領(lǐng)域具有十分廣闊的應(yīng)用前景。如在醫(yī)療領(lǐng)域,P

2、HB可以作為藥物基質(zhì)植入人體,以控制藥物的釋放,且最終降解產(chǎn)物為β-羥基丁酸,對人體沒有任何毒副作用。
　　 本文從自然環(huán)境分離得到一株較高產(chǎn)PHB巨大芽孢桿菌菌株Bm-10,通過培養(yǎng)條件、培養(yǎng)基組分優(yōu)化,提高PHB產(chǎn)量,發(fā)酵小試初步確定搖瓶發(fā)酵條件與發(fā)酵罐發(fā)酵條件的相對一致性；通過提取條件優(yōu)化提高PHB的提取效率,從而最大化PHB產(chǎn)量；最后對實驗中獲得的提取物進行純化分析,判斷其結(jié)構(gòu)、純度等。
　　 首先,從浙江省各地

3、(紹興、寧波、金華、杭州、臺州、麗水、溫州)采集的土壤(主要來源有河底淤泥、排污口岸泥土、花壇土壤、菜地土壤等)中分離篩選芽孢桿菌菌株416株。通過對PHB的定性、定量篩選等手段獲得較高產(chǎn)PHB菌株,同時進行連續(xù)傳代培養(yǎng)以獲得PHB產(chǎn)量及遺傳性狀穩(wěn)定的目的菌株。
　　 其次,采用單因素法優(yōu)化發(fā)酵條件,培養(yǎng)基中的碳源、氮源及兩者比例。利用響應(yīng)面法研究對PHB產(chǎn)量影響較大的4個因素(蔗糖濃度、牛肉膏濃度、初始pH、培養(yǎng)溫度)之間的交

4、互關(guān)系以及最佳值。利用響應(yīng)面法建立回歸方程。通過計算獲得最優(yōu)發(fā)酵條件為:初始pH為7.40,培養(yǎng)溫度為29.81℃,蔗糖濃度為48.48 g／L,牛肉高濃度為26.06g／L。經(jīng)過單因素及響應(yīng)面優(yōu)化后Bm-10的PHB產(chǎn)量為5.308 g／L,比篩選時PHB產(chǎn)量(0.76 g／L)提高6.98倍。
　　 第三,在搖瓶發(fā)酵條件優(yōu)化的基礎(chǔ)上,研究菌株Bm-10應(yīng)用于工業(yè)化的潛力。以菌體情況、PHB產(chǎn)量、PHB所占菌體百分比及溶氧情況

5、為檢測指標(biāo),在3.7L發(fā)酵罐上進行研究,為實驗室后期優(yōu)化生產(chǎn)PHB打下一定基礎(chǔ)。
　　 第四,為了盡可能的使PHB產(chǎn)量最大化,還對提取工藝進行了初步研究。主要從單因素實驗的基礎(chǔ)上再進行響應(yīng)面優(yōu)化提取條件。從單因素實驗得出當(dāng)提取液中氯仿濃度75％,提取溫度60℃,提取時間3.0 h。通過響應(yīng)面法優(yōu)化PHB提取條件,得到一個二次多項式回歸模型(R2=0.9953),模型失擬項不顯著(P=0.058>0.05),擬合度良好,這說明采用

6、響應(yīng)面法得到的工藝參數(shù)較為可信。最終結(jié)果表明PHB的最佳提取條件:氯仿濃度69.7％,提取溫度59.7℃,提取時間3.0h。
　　 最后,將實驗提取獲得的粉末狀或薄膜狀固體采用紫外吸收光譜(UV)、核磁共振(NMR)等手段進行了分析,并與標(biāo)準(zhǔn)品進行比較。紫外吸收光譜中無雜質(zhì)峰并且與PHB標(biāo)準(zhǔn)品的吸收峰一致,證明提取產(chǎn)物較純,初步確定該提取物為PHB類似物,在濃硫酸降解過程中出現(xiàn)巴豆酸；核磁共振中的氫譜和碳譜分析可知,該提取物的結(jié)