CYR1基因啟動(dòng)子改造對(duì)釀酒酵母耐受性的影響研究.pdf

1、釀酒酵母因其具有優(yōu)良的生長(zhǎng)和發(fā)酵性能，而被廣泛應(yīng)用于乙醇和食品工業(yè)。在發(fā)酵過(guò)程中，有很多不可避免的脅迫環(huán)境出現(xiàn)，如高溫、高滲等，這些環(huán)境會(huì)抑制細(xì)胞生長(zhǎng)、降低細(xì)胞發(fā)酵能力，給相關(guān)發(fā)酵行業(yè)帶來(lái)一定的經(jīng)濟(jì)損失。所以構(gòu)建具有良好耐受性的酵母菌種在工業(yè)應(yīng)用方面具有重要的意義。CYR1基因編碼的腺苷酸環(huán)化酶是Ras-cAMP信號(hào)通路的關(guān)鍵酶，Ras-cAMP信號(hào)通路在調(diào)節(jié)酵母細(xì)胞壓力抗性中起著重要的作用。所以本研究從改變CYR1（腺苷酸環(huán)化酶編碼基

2、因）啟動(dòng)子的長(zhǎng)度來(lái)實(shí)現(xiàn)微調(diào)控CYR1基因的表達(dá)水平，達(dá)到使酵母細(xì)胞具有良好耐受性的同時(shí)能夠正常發(fā)酵的目的。主要研究?jī)?nèi)容及結(jié)果如下:
　　(1)以整合型質(zhì)粒YIplac211為載體，構(gòu)建一系列CYR1基因啟動(dòng)子的3'端序列部分缺失的的重組質(zhì)粒，缺失梯度為30 bp。以URA3基因作為篩選標(biāo)記，利用重組質(zhì)粒通過(guò)兩步重組法實(shí)現(xiàn)釀酒酵母菌株AY15a的CYR1基因啟動(dòng)子3'端序列的部分缺失，并且無(wú)任何外源基因殘留。CYR1基因啟動(dòng)子3'端

3、部分缺失突變株AY15a-30、AY15a-60、AY15a-90、AY15a-120和AY15a-150的CYR1基因的mRNA水平分別是親本菌株AY15a的89.1％，76.8％，60.1％，56.7％和41.3％。耐受性實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:CYR1基因啟動(dòng)子的3'端缺失90 bp和120 bp的菌株AY15a-90和AY15a-120具有耐熱性能，對(duì)8％(v/v)的乙醇也具有一定的耐受性。玉米原料濃醪發(fā)酵結(jié)果顯示:突變株AY15a-90

4、和AY15a-120的30℃發(fā)酵性能和親本菌株AY15a類似;當(dāng)發(fā)酵溫度升高為40℃時(shí)，AY15a-90和AY15a-120的發(fā)酵性能相對(duì)親本菌株有明顯的提高，AY15a-90和AY15a-120的乙醇產(chǎn)量相對(duì)親本菌株AY15a分別提高了14.0％和14.6％。
　　(2)以URA3基因作為篩選標(biāo)記，利用重組質(zhì)粒通過(guò)兩步重組法實(shí)現(xiàn)面包酵母BY-14α的CYR1基因啟動(dòng)子3'端序列缺失90 bp和120 bp，獲得面包酵母突變株BY