基于核酸適配體的納米熒光生物傳感器對(duì)蛋白質(zhì)的研究.pdf

1、本論文運(yùn)用核酸適配體結(jié)合磁性納米材料制作生物傳感器。以核酸適配體為蛋白的識(shí)別元件，具有可以與抗原或抗體識(shí)別目標(biāo)分子相媲美的選擇性和專(zhuān)一性。磁性納米顆粒的運(yùn)用，可很好的分離和富集目標(biāo)蛋白，消除雜蛋白的非特異性吸附干擾，降低熒光背景，提高信噪比，使檢測(cè)具有理想的靈敏度。該方法簡(jiǎn)單易行，在磁性納米顆粒表面生長(zhǎng)碳臂后，還可以同時(shí)檢測(cè)樣品中的雙蛋白。全文分為四章： 第一章：緒論。介紹了蛋白質(zhì)檢測(cè)的目的與意義，對(duì)現(xiàn)代蛋白檢測(cè)的幾種方法作了簡(jiǎn)

2、單的分析與評(píng)述，著重分析了目前熒光光度法檢測(cè)蛋白的方法進(jìn)展。核酸適配體用于檢測(cè)蛋白的優(yōu)勢(shì)和運(yùn)用磁性納米顆粒分離蛋白的優(yōu)越性，提出本論文的目的意義及創(chuàng)新之處。該生物傳感器具有高特異性、高靈敏度的優(yōu)點(diǎn)。利用此傳感器檢測(cè)目標(biāo)蛋白，研究核酸適配體與目標(biāo)蛋白的相互作用，取得了良好的結(jié)果。運(yùn)用非三明治結(jié)構(gòu)的熒光納米生物傳感器，可同時(shí)檢測(cè)樣品中的多組蛋白。 第二章：基于核酸適配體的新型熒光納米生物傳感器測(cè)定凝血酶的研究。凝血酶(thrombi

3、n)是一種重要的生理蛋白酶，在血液凝固、炎癥和創(chuàng)傷愈合等生理及病理過(guò)程中發(fā)揮重要作用，檢測(cè)凝血酶在醫(yī)學(xué)上有重要意義。利用凝血酶的兩核酸適配體與凝血酶的高親和力構(gòu)建三明治結(jié)構(gòu)，通過(guò)磁性納米顆粒的磁性分離技術(shù)，設(shè)計(jì)一種新型的熒光納米生物傳感器檢測(cè)凝血酶。該法對(duì)凝血酶的響應(yīng)線性范圍為2.24×10-11mol/L～4.03×10-9mol/L,其線性方程為I=0.9758×1011×Gthrombin-2.628,檢測(cè)限1×10-11mol/

4、L，對(duì)2.68×10-10mol/L，R.S.D為3.29％，測(cè)得的熒光信號(hào)穩(wěn)定，24h后測(cè)定并無(wú)衰減。研究結(jié)果表明，此新型的熒光納米生物傳感器制作簡(jiǎn)單，檢測(cè)具有很高的特異性和靈敏度，并有望運(yùn)用于生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域檢測(cè)凝血酶。 第三章：基于核酸適配體的熒光納米生物傳感器研究。凝血酶與其核酸適配體的相互作用核酸適配體作為一種分子元件可用于蛋白的檢測(cè)，其與蛋白的作用受到重視。利用基于核酸適配體的熒光生物傳感器初步探索了兩核酸適配體與凝血酶

5、鍵合兩不同作用位點(diǎn)。凝血酶與兩核酸適配體以1：1的比例鍵合。29個(gè)堿基的核酸適配體與凝血酶作用較強(qiáng)，解離常數(shù)為4nM。15個(gè)堿基的核酸適配體與凝血酶作用相對(duì)稍弱，解離常數(shù)為21nM。從核酸適配體與凝血酶作用的結(jié)構(gòu)上分析了，造成這種作用力差別的原因。實(shí)驗(yàn)證明，基于核酸適配體的熒光納米生物傳感器不僅可對(duì)目標(biāo)蛋白進(jìn)行定量定性分析，還研究其相互作用。 第四章：基于核酸適配體熒光納米生物傳感器對(duì)雙組分蛋白的檢測(cè)。通過(guò)在磁性納米顆粒表面生長(zhǎng)

6、碳臂來(lái)固定目標(biāo)蛋白質(zhì)分子，用不同熒光分子標(biāo)記與目標(biāo)蛋白對(duì)應(yīng)的核酸適配體。蛋白分子與對(duì)應(yīng)的核酸適配體結(jié)合后，磁性分離未鍵合的熒光分子。將磁性分離后的蛋白質(zhì)配制成溶液，測(cè)定其不同波長(zhǎng)下的熒光強(qiáng)度可對(duì)雙蛋白組分進(jìn)行定性和定量分析。本文探索了磁性納米顆粒表面生長(zhǎng)碳臂通過(guò)共價(jià)鍵合作用固定蛋白的條件，對(duì)比了此蛋白固定方式與核酸適配體固定蛋白方式在同濃度蛋白的檢測(cè)時(shí)產(chǎn)生的信號(hào)差異，分析了兩種固定方式各自的優(yōu)點(diǎn)。對(duì)同一樣品中雙組分蛋白同時(shí)進(jìn)行了定量分析

7、。目標(biāo)蛋白(凝血酶與溶菌酶)濃度在1.20×10-9mol/L至7.50×10-8mol/L之間時(shí)，熒光峰強(qiáng)度與蛋白濃度成線性，其線性方程分別為I=62.09×109Cthrombin+1.7213，相關(guān)系數(shù)r為0.9962；I=31.32×109Clysozyme+33.53，r=0.9908，凝血酶檢測(cè)限為6.2×10-10mol/L，溶菌酶檢測(cè)限為9.5×10-10mol/L。此方法可同時(shí)檢測(cè)樣品中的雙蛋白組分，檢測(cè)信號(hào)互不干擾，