基于核酸適體和納米材料的熒光生物傳感器的研究.pdf

1、核酸適體是由25～80個(gè)堿基組成的能與蛋白質(zhì)、多肽、金屬離子、小分子等特異性結(jié)合的寡核苷酸DNA或RNA鏈。自從1990年Gold和Ellington等實(shí)驗(yàn)室各自獨(dú)立地建立自己的核苷酸文庫(kù)并創(chuàng)立一種從超過(guò)1015個(gè)核苷酸分子文庫(kù)里篩選出能與配體專(zhuān)一、高效結(jié)合的DNA或RNA片段的指數(shù)級(jí)富集的配基系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)(SELEX)以來(lái)，適體的合成與研究引起了越來(lái)越多的科研工作者的關(guān)注。適體的出現(xiàn)彌補(bǔ)了傳統(tǒng)抗體的不足，也為傳統(tǒng)免疫傳感器注入了新的活

2、力。
　　納米材料是指顆粒尺寸在1～100 nm范圍內(nèi)的超微粒子或其組裝結(jié)構(gòu)，由于其處于微觀區(qū)域，具有許多與同質(zhì)分子不同的物理化學(xué)性質(zhì)，如不同尺寸和形狀的納米粒子表現(xiàn)出顯著不同的光學(xué)性質(zhì)及特殊的磁、電、熱力學(xué)等性能。將納米材料和生物分子識(shí)別事件進(jìn)行結(jié)合將代表納米技術(shù)在分子診斷工具新發(fā)展中的一個(gè)新方向。納米材料以其優(yōu)異的光學(xué)和電學(xué)性能，為生物傳感器的發(fā)展提供了新的契機(jī)。在生物傳感器中，納米材料的使用，使得檢測(cè)的靈敏度大大提高。至今，

3、基于納米材料的生物傳感器已被應(yīng)用于DNA、蛋白質(zhì)、多肽等多種生物分子的檢測(cè)。在利用納米材料構(gòu)建生物傳感器的過(guò)程中，關(guān)鍵的一步在于如何將納米材料的優(yōu)勢(shì)與生物識(shí)別事件結(jié)合起來(lái)。通過(guò)巧妙和精心的設(shè)計(jì)，構(gòu)建高靈敏度的納米生物傳感器仍然是生物傳感器領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。
　　本論文利用多壁碳納米管(MWCNTs)、氧化石墨烯(GO)的獨(dú)特光學(xué)性質(zhì)與核酸適體與目標(biāo)分析物結(jié)合的高親合力和高特異性進(jìn)行有機(jī)結(jié)合，建立了幾種新型熒光生物傳感器。具體內(nèi)容如下

4、:
　　(1)基于核酸適體的熒光偏振(FP)方法通常不直接應(yīng)用于小分子的檢測(cè)，因?yàn)槟繕?biāo)物分子體積太小很難產(chǎn)生可以觀測(cè)到的FP信號(hào)變化。本論文建立了一種基于非競(jìng)爭(zhēng)型的檢測(cè)小分子的熒光偏振傳感技術(shù)。以腺苷作為小分子分析目標(biāo)，腺苷核酸適體作為識(shí)別探針，該探針包含兩條DNA單鏈(ssDNA)，其中一條用熒光染料(FAM)標(biāo)記，另一條攜有長(zhǎng)鏈(T20)。只有探針識(shí)別腺苷分子并與其鍵合時(shí)，該適體DNA單鏈才相互作用結(jié)合在一起形成適體/目標(biāo)復(fù)合

5、物，因而顯著增大熒光團(tuán)分子體積。與未結(jié)合前比較，熒光團(tuán)的這種分子尺寸的增大，降低熒光團(tuán)的旋轉(zhuǎn)速率，導(dǎo)致熒光偏振值增加。通過(guò)測(cè)定熒光偏振值(P)的變化量，可以實(shí)現(xiàn)對(duì)目標(biāo)物腺苷的定量分析。此傳感器檢測(cè)范圍高達(dá)5個(gè)數(shù)量級(jí)(50 nmol/L～1.0 mmol/L)，檢測(cè)限為26 nmol/L，比以往報(bào)道的非競(jìng)爭(zhēng)型的適體熒光偏振(FP)傳感器的靈敏度至少提高2～3個(gè)數(shù)量級(jí)。
　　(2)基于核酸適體的特異性識(shí)別作用結(jié)合和多壁碳納米管(MWC

6、NTs)的超強(qiáng)熒光猝滅能力，以Hg2+、Ag+、Pb2+為分析物，構(gòu)建了一種能夠檢測(cè)多種重金屬離子的多色納米熒光傳感器。在該體系中，三種標(biāo)記了不同熒光染料的核酸適體通過(guò)π-π堆積作用共同組裝在MWCNTs表面形成多色納米熒光傳感器。由于自組裝作用拉近了MWCNTs與熒光染料的距離，因此所有熒光染料的熒光通過(guò)熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)被猝滅。當(dāng)金屬離子存在時(shí)，核酸適體和金屬離子之間的特異性結(jié)合抑制適體和MWCNTs之間的相互作用，使熒光

7、標(biāo)記的適體鏈脫離MWCNTs表面，從而使染料的熒光恢復(fù)。由于MWCNTs的高比表面積能夠在其表面組裝不同熒光染料標(biāo)記的多種適體探針，通過(guò)檢測(cè)不同染料的熒光變化可以實(shí)現(xiàn)多種金屬離子的測(cè)定。每種適體只能識(shí)別一種金屬離子Hg2+、Ag+或Pb2+，當(dāng)它們與其對(duì)應(yīng)的金屬離子鍵合后從MWCNTs表面釋放，使相應(yīng)染料熒光信號(hào)的增強(qiáng)與其相應(yīng)的金屬離子濃度的增加量對(duì)應(yīng)，因此，該適體/MWCNTs傳感體系可實(shí)現(xiàn)同一溶液中多種金屬離子的同時(shí)檢測(cè)。該傳感器檢

8、測(cè)限分別為15 nmol/L(Hg2+)、18 nmol/L（Ag+）和20nmol/L(Pb2+)。
　　(3)基于氧化石墨烯(GO)的高效熒光猝滅能力，構(gòu)建了一種熒光共振能量轉(zhuǎn)移的適體傳感器，成功用于血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的檢測(cè)。該體系采用熒光標(biāo)記的抗-VEGF核酸適體作為識(shí)別探針，熒光標(biāo)記的抗-VEGF適體通過(guò)π-π堆積作用吸附組裝在GO表面，由于熒光染料與GO之間的距離拉近，從而熒光共振能量從熒光染料轉(zhuǎn)移到GO，導(dǎo)致

9、熒光猝滅。當(dāng)目標(biāo)VEGF存在時(shí)，適體識(shí)別和鍵合目標(biāo)物VEGF后，形成適體/VEGF復(fù)合物，并從GO表面脫離下來(lái)，從而使染料的熒光信號(hào)恢復(fù)。通過(guò)監(jiān)測(cè)鍵合前后熒光信號(hào)的變化，可以實(shí)現(xiàn)VEGF的定量分析。此傳感器不僅選擇性好，而且檢測(cè)限也低（2.5×10-10 mol/L），并應(yīng)用于人血清樣中VEGF的測(cè)定。
　　(4)由于大尺寸目標(biāo)分子能夠引起適體探針構(gòu)象變化從而產(chǎn)生熒光偏振信號(hào)變化，本論文在第五章提出了一種基于熒光偏振的適體傳感器，

10、用于血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(VEGF)的檢測(cè)。當(dāng)沒(méi)有目標(biāo)分子存在時(shí)，熒光標(biāo)記的核酸適體處于游離的單鏈狀態(tài)，此時(shí)體系的P值很小。當(dāng)加入VEGF后，它與核酸適體結(jié)合，形成G-四鏈體結(jié)構(gòu)的適體/VEGF復(fù)合物，從而導(dǎo)致體系的P值明顯增大。據(jù)此可用于定量測(cè)定VEGF。該傳感器靈敏、選擇性好、試劑消耗少，更重要的是，該方法不需要復(fù)雜的分離、洗滌步驟，整個(gè)過(guò)程都在均相中完成。
　　(5)利用酶催化反應(yīng)的高度特異性和碳納米管的超強(qiáng)熒光猝滅能力，構(gòu)建了

11、一種新型的納米傳感器用于酶活性的檢測(cè)。在該傳感體系中，首先熒光標(biāo)記的核酸適體單鏈DNA和多壁碳納米管(MWCNTs)混合后，適體單鏈DNA非共價(jià)吸附在多壁碳納米管(MWCNTs)側(cè)壁表面，標(biāo)記的熒光染料由于與MWCNTs距離拉近而被猝滅，具有很小的熒光背景。當(dāng)加入靶標(biāo)分子腺苷后，適體DNA和腺苷結(jié)合形成雙鏈DNA結(jié)構(gòu)，熒光標(biāo)記的適體DNA脫離MWCNTs表面，染料標(biāo)記的適體恢復(fù)熒光發(fā)射。但加入目標(biāo)酶時(shí)，靶標(biāo)物質(zhì)腺苷被酶催化分解，因而不能