銅綠假單胞菌las群體感應(yīng)系統(tǒng)反義肽核酸的構(gòu)建及其生物學(xué)作用研究.pdf_第1頁
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文檔簡介

1、目的:
  1.針對銅綠假單胞菌las群體感應(yīng)系統(tǒng)的lasR和lasI基因,設(shè)計和篩選出與其mRNA緊密結(jié)合的反義寡核苷核酸序列,以此為基礎(chǔ)設(shè)計合成反義肽核酸。
  2.評估反義肽核酸對銅綠假單胞菌PAO1的生長、lasR和lasI基因表達(dá)、生物被膜形成及毒力因子表達(dá)的影響。
  方法:
  一、銅綠假單胞菌PAO1lasR和lasI基因反義肽核酸的設(shè)計與篩選
  1.銅綠假單胞菌PAO1lasR和lasI

2、基因反義寡核苷酸的設(shè)計與篩選
  1.1目的基因的擴(kuò)增:根據(jù)GeneBank數(shù)據(jù)庫提供的銅綠假單胞菌PAO1lasR和lasI全長基因序列,用軟件Primer Primer6.0設(shè)計擴(kuò)增引物,進(jìn)行l(wèi)asR和lasI基因的PCR擴(kuò)增。
  1.2構(gòu)建lasR和lasI基因mRNA表達(dá)質(zhì)粒:回收并純化lasR和lasI基因擴(kuò)增產(chǎn)物,與質(zhì)粒載體pGEM-T easy vector進(jìn)行連接重組。
  1.3重組質(zhì)粒pGEM-T

3、 easy vector-lasR/lasI的驗(yàn)證:重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)菌DH5α,利用藍(lán)白斑實(shí)驗(yàn)篩選出陽性克隆。擴(kuò)增后提取pGEM-T easy vector-lasR/lasI質(zhì)粒并進(jìn)行pGEM-T easy vector-lasR/lasI Not I酶切鑒定和測序鑒定。
  1.4利用軟件RNA structure5.2設(shè)計lasR和lasI基因mRNA反義寡核苷酸序列。
  1.5反義寡核苷酸的篩選:進(jìn)行l(wèi)asR/

4、lasI mRNA體外轉(zhuǎn)錄,利用斑點(diǎn)雜交實(shí)驗(yàn)篩選出反義寡核苷酸序列。
  2.銅綠假單胞菌PAO1lasR和lasI基因反義肽核酸的設(shè)計與合成
  依據(jù)篩選出的反義寡核苷酸序列,按照肽核酸設(shè)計原則設(shè)計合成銅綠假單胞菌PAO1lasR和lasI基因反義肽核酸,并將其與穿膜肽(KFF)3K連接。
  二、銅綠假單胞菌PAO1lasR和lasI基因反義肽核酸生物學(xué)作用研究
  1.反義肽核酸對銅綠假單胞菌PAO1las

5、R和lasI基因表達(dá)的影響:利用qPCR方法檢測lasR和lasI基因mRNA相對表達(dá)量。
  2.反義肽核酸對銅綠假單胞菌PAO1生長的影響:酶標(biāo)儀測定LB液體培養(yǎng)基中銅綠假單胞菌PAO1OD600和LB固體培養(yǎng)基計數(shù)菌落。
  3.反義肽核酸對銅綠假單胞菌PAO1生物被膜形成的影響:光學(xué)顯微鏡、掃描電鏡和激光共聚焦顯微鏡觀察生物膜內(nèi)細(xì)菌含量。
  4.反義肽核酸對銅綠假單胞菌PAO1毒力因子表達(dá)的影響:采用ELIS

6、A技術(shù)檢測銅綠假單胞菌PAO1外毒素A、綠膿菌素含量的變化,qPCR方法檢測彈力蛋白酶lasB基因mRNA相對表達(dá)量。
  結(jié)果:
  一、銅綠假單胞菌PAO1lasR和lasI基因反義肽核酸的設(shè)計與篩選
  1.成功構(gòu)建lasR和lasI基因mRNA表達(dá)重組質(zhì)粒pGEM-T easy vector-lasR/lasI,篩選出與銅綠假單胞菌PAO1lasR和lasI基因mRNA緊密結(jié)合的反義寡核苷酸序列。
  2

7、.以篩選出的反義寡核苷酸序列為基礎(chǔ)合成反義肽核酸,并將其與穿膜肽結(jié)合構(gòu)建了穿膜肽-肽核酸。
  二、銅綠假單胞菌PAO1lasR和lasI基因反義肽核酸生物學(xué)作用研究
  1.lasR/lasI穿膜肽-肽核酸抑制lasR/lasImRNA的表達(dá),與對照組相比,其表達(dá)量有顯著差異,并且隨著穿膜肽-肽核酸濃度增加,對lasR/lasImRNA的表達(dá)抑制作用增強(qiáng)。
  2.lasR/lasI穿膜肽-反義肽核酸濃度≧40μM時

8、,對銅綠假單胞菌PAO1的生長有明顯抑制作用,濃度越高,對生長的抑制作用越明顯。而穿膜肽和反義肽核酸本身對細(xì)菌的生長無明顯抑制作用。
  3.光學(xué)顯微鏡、掃描電鏡和激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果顯示,lasR/lasI穿膜肽-肽核酸轉(zhuǎn)染的銅綠假單胞菌PAO1,其生物被膜的形成明顯抑制。
  4.lasR/lasI調(diào)控的毒力因子彈性蛋白酶lasB、綠膿菌素和外毒素A等在穿膜肽-肽核酸的作用下表達(dá)量均下降,與陰性對照組相比,差異有統(tǒng)計

9、學(xué)意義。
  結(jié)論:
  1.通過體外表達(dá)和斑點(diǎn)雜交實(shí)驗(yàn),成功效篩選出與目的基因lasR/lasI mRNA緊密結(jié)合的反義寡核苷酸序列,并在此基礎(chǔ)上成功設(shè)計合成反義肽核酸并構(gòu)建了穿膜肽連接的穿膜肽-肽核酸。
  2.穿膜肽-肽核酸明顯抑制lasR/lasI mRNA的表達(dá),實(shí)現(xiàn)對銅綠假單胞菌las群體感應(yīng)系統(tǒng)的淬滅。
  3.lasR/lasI mRNA穿膜肽-肽核酸能夠顯著抑制銅綠假單胞菌PAO1生物被膜的形成

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