BHLDNA適配體對銅綠假單胞菌群體感應(yīng)系統(tǒng)抑制作用的研究.pdf

1、目的：
　　研究BHL DNA適配體能否在體外有效干擾銅綠假單胞菌群體感應(yīng)系統(tǒng)，抑制其生物被膜形成，并干擾浮游菌綠膿菌素的生物合成。
　　方法：
　　1.體外培養(yǎng)銅綠假單胞菌，觀察高濃度BHL DNA適配體是否影響銅綠假單胞菌生長曲線。
　　2.體外干擾銅綠假單胞菌生物被膜的形成：體外構(gòu)建銅綠假單胞菌生物被膜模型，給予高濃度BHL DNA適配體進行成膜干擾；光學(xué)顯微鏡觀察生物被膜形態(tài)學(xué)變化；結(jié)晶紫染色法定量測定生

2、物被膜。
　　3.體外干擾銅綠假單胞菌綠膿菌素的產(chǎn)生：設(shè)計適配體組、陰性對照組和文庫對照組，培養(yǎng)48小時后采用氯仿萃取法定量測定銅綠假單胞菌綠膿菌素含量。
　　4.細胞外DNA（extracellular DNA eDNA）對BHL DNA適配體抑制銅綠假單胞菌生物被膜形成的影響：氯化鋰裂解法抽提銅綠假單胞菌基因組DNA（Genomic DNA gDNA），設(shè)計適配體組、陰性對照組、gDNA組和適配體+gDNA組，培養(yǎng)48小

3、時后結(jié)晶紫染色法定量測定生物被膜。
　　結(jié)果：
　　1.培養(yǎng)基中含有高濃度BHL DNA適配體時，銅綠假單胞菌的生長曲線與不含適配體的高度一致，并未出現(xiàn)適配體抑制或促進細菌增殖情況。
　　2.體外干擾銅綠假單胞菌生物被膜的形成：光學(xué)顯微鏡觀察陰性對照和文庫對照均顯示大片致密的膜狀結(jié)構(gòu)。而適配體干擾組Aptamer1、2、16、46則顯示出了單個菌體分布或是疏松網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。Aptamer16干擾下的生物被膜生長幾乎被破壞，

4、鏡下存在大量散在的單個菌體。結(jié)晶紫染色定量測定生物被膜量，陰性對照組與文庫對照組的測定值高于適配體組（P＜0.05）,而陰性對照組與文庫對照組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　3.體外干擾銅綠假單胞菌綠膿菌素的生物合成：適配體組綠膿菌素值低于陰性對照組和文庫對照組（P＜0.05）,而陰性對照組與文庫對照組之間差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　4.細胞外DNA（extracellular DNA eDNA）對BHL DNA適配體抑制銅綠假單胞

5、菌生物被膜形成的影響：陰性對照組生物被膜定量測定高于適配體組（P＜0.05），但低于gDNA組和gDNA+適配體組（P＜0.05）；適配體組定量測定值低于gDNA組和gDNA+適配體組（P＜0.05）；gDNA組高于gDNA+適配體組（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.BHL DNA適配體不影響細菌增殖，不影響最終體系細菌密度。
　　2.BHL DNA適配體在體外可有效干擾銅綠假單胞菌生物被膜的形成；
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