肝干細胞在膽汁淤積性肝硬化中分化及高表達CXCR4-CXCR7對肝干細胞增殖、遷移、抗氧化應激損傷的研究.pdf

1、目的：
　　探究膽汁淤積性肝硬化患兒肝臟中肝干細胞的動員，建立及評價膽汁淤積性肝硬化小鼠模型，經(jīng)脾臟體內(nèi)移植肝干細胞HP14-19，探討HP14-19在膽汁淤積性肝硬化中的分化。重組腺病毒Ad-CXCR4和Ad-CXCR7誘導肝干細胞，探討SDF-1/CXCR4和SDF-1/CXCR7對HP14-19增殖、遷移和抗氧化應激損傷的影響。
　　方法：
　　1.隨機選取我院100例BA患兒為實驗組，20例膽總管囊腫患兒為對照

2、組，比較血清AFP水平；選取20例膽道閉鎖患兒和20例膽總管囊腫患兒肝臟組織標本行免疫組織化學檢測卵圓細胞標志物ov-6,c-kit的表達情況。
　　2.84只balb/c小鼠隨機分為實驗組（56只）和對照組（28只），實驗組采用腹中線小切口行膽總管結扎手術，對照組行假手術。術后觀察小鼠一般情況及肝臟大體結構；全自動生化分析儀檢測實驗組與對照組術后1d、3d、5d、7d、14d、21d、28d血清肝臟生化指標（TBIL、DBIL、

3、ALT、AST）；H&E染色觀察術后相應時間點肝臟組織形態(tài)學改變；術后28d小鼠肝臟組織行masson染色和免疫組織化學檢測，觀察實驗組和對照組膠原纖維與a-SMA、CK-19蛋白的表達情況。
　　3.紅色熒光蛋白RFP-luc標記HP14-19，經(jīng)脾臟體內(nèi)移植至膽汁淤積性肝硬化小鼠模型中，對照組回輸PBS，活體成像檢測HP14-19在損傷肝臟的定植情況。熒光染料PKH26標記HP14-19，顯微鏡和檢測HP14-19在膽汁淤積性

4、肝硬化中的定植及分化情況。
　　4.重組腺病毒Ad-CXCR4和Ad-CXCR7感染HP14-19細胞,流式細胞術和Western blot檢測細胞膜上CXCR4/CXCR7受體的表達;MTT法檢測細胞增殖;Transwell法檢測細胞遷移;過氧化氫(H2O2)處理細胞建立氧化應激損傷模型, MTT法檢測細胞活力;酶學法檢測LDH和SOD活性，評價CXCR4/CXCR7介導SDF-1誘導HP14-19細胞增殖、遷移和抗氧化應激損傷

5、作用。
　　結果：
　　1.100例實驗組患兒中有92例患兒血清AFP明顯上調(diào),而對照組患兒均在正常范圍；實驗組患兒肝臟組織免疫組織化學染色ov-6、c-kit表達水平明顯高于對照組（P＜0.01）。
　　2.與對照組相比，實驗組小鼠術后一般情況較差，膽囊、膽總管擴張，膽汁淤積；血清肝臟生化指標顯著升高（P＜0.05），肝臟組織HE染色見肝小葉結構改變，膽管增生；術后28d肝臟組織masson染色可見實驗組有膠原纖維形

6、成，免疫組織化學染色a-SMA、CK-19表達明顯高于對照組（P＜0.05）。
　　3.活體成像技術和顯微鏡下顯示實驗組HP14-19經(jīng)脾臟體內(nèi)移植后在損傷肝臟中有表達，共聚焦顯微鏡尚未觀察到表達PKH26的HP14-19表達膽管上皮細胞標志物CK-19。
　　4.感染腺病毒Ad-CXCR4/CXCR7后, HP14-19細胞膜CXCR4/CXCR7受體水平顯著上調(diào);高表達CXCR7可增強細胞增殖活性,而對CXCR4無顯著效

7、果;高表達CXCR4或CXCR7可顯著增強SDF-1誘導的HP14-19細胞的遷移和氧化應激狀態(tài)下的細胞存活率,其中，CXCR7對遷移效應較強;與對照組比較,高表達CXCR4或CXCR7可降低H2O2造成的細胞氧化損傷，LDH活性,增高SOD活性。
　　結論：
　　卵圓細胞存在于膽道閉鎖患兒肝臟組織中，參與肝臟損害、膽汁淤積性肝硬化等病理過程。小鼠腹中線小切口膽總管結扎手術可成功構建膽汁淤積性肝硬化模型，肝干細胞經(jīng)脾臟體內(nèi)移