一種來(lái)源于Burkholderia cenocepacia的羰基還原酶的克隆表達(dá)及應(yīng)用研究.pdf

1、(R)-3，5-雙三氟甲基苯乙醇((R)-BTPE)是合成手性藥物阿瑞匹坦的關(guān)鍵中間體，可通過(guò)不對(duì)稱還原3，5-雙三氟甲基苯乙酮(BTA)獲得。通過(guò)基因挖掘的方法，發(fā)現(xiàn)來(lái)源于Burkholderia cenocepacia的羰基還原酶Bc-3(WP_012492403.1)能夠催化BTA還原生成anti-prelog規(guī)則的產(chǎn)物(R)-BTPE，ee＞99.9％。Bc-3屬于短鏈脫氫酶，氨基酸殘基數(shù)為247，蛋白大小約為26KDa，空間結(jié)

2、構(gòu)上是典型的Rossmann折疊，具有輔酶結(jié)合域及Ser-Tyr-Lys的催化三聯(lián)體的保守序列。本研究中構(gòu)建了E.coli基因工程菌，全細(xì)胞不對(duì)稱還原BTA的最適反應(yīng)溫度為25℃，最適反應(yīng)pH為7.0，除了Cu2+和Ni2+，大多數(shù)金屬離子促進(jìn)反應(yīng)進(jìn)行，Mn2+最為明顯，此外，Bc-3對(duì)苯乙酮及鄰氟苯乙酮的相對(duì)活性分別達(dá)到了119.5％和200.1％。
　　3-[5-（4-氟苯基）-5(S)-羥基戊?；鵠-4(S)-4-苯基-1，

3、3-噁唑-2-酮((S)-FOP-醇）是合成降血脂藥物依折麥布的關(guān)鍵中間體，可通過(guò)不對(duì)稱還原3-[5-（4-氟苯基）-5-羰基戊?；鵠-4(S)-4-苯基-1，3-噁唑-2-酮（FOP-酮）獲得。對(duì)Bc-3進(jìn)行定點(diǎn)突變，研究了142位點(diǎn)及185位點(diǎn)對(duì)底物BTA和FOP-酮不對(duì)稱還原的影響。N142S、Y185C、Y185F、Y185N、N142S/Y185C突變體降低了對(duì)BTA的催化活性和對(duì)映體選擇性;相反，五株突變體對(duì)FOP-酮的不對(duì)