功能表達(dá)來(lái)源于Klebsiella oxytoca KCTC1686的腈水合酶和酰胺酶及其應(yīng)用.pdf

1、腈水合酶(NHase，E.C.4.2.1.84)和酰胺酶(Amidase，EC3.5.1.4)是微生物體內(nèi)腈類化合物代謝途徑中的兩個(gè)關(guān)鍵酶。這兩種酶在醫(yī)藥和精細(xì)化學(xué)品中間體的制備中發(fā)揮著重要作用，但在實(shí)際工業(yè)應(yīng)用中還存在著酶的表達(dá)量偏低、表達(dá)不穩(wěn)定和產(chǎn)物純度不高等問(wèn)題。S-2-(4-氯苯基)-3-甲基丁酸(S-CPIAC)是合成S-氰戊菊酯的重要手性中間體，其可由腈水合酶和酰胺酶耦合催化2-(4-氯苯基)-3-甲基丁腈(CPIN)來(lái)制備

2、。目前能催化該反應(yīng)的酶數(shù)量少、催化活性低。因此，研究腈水合酶和酰胺酶的重組表達(dá)，進(jìn)一步開(kāi)發(fā)催化性能更好的酶，具有重要的理論意義和實(shí)用價(jià)值。本論文以腈水合酶和酰胺酶耦合催化CPIN合成S-CPIAC為模型，用基因組探礦的方法從生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)中挖掘新型腈水合酶和酰胺酶基因，分別實(shí)現(xiàn)其在E.coli中的高效表達(dá);構(gòu)建一菌多酶共表達(dá)體系，實(shí)現(xiàn)腈水合酶和酰胺酶耦合催化在制備S-CPIAC中的應(yīng)用。主要內(nèi)容如下：
　　(1)腈水合酶酶庫(kù)的構(gòu)建

3、。目前已報(bào)道的只有三個(gè)微生物能催化CPIN水解生成2-(4-氯苯基)-3-甲基丁酰胺(CPIAm)。因鈷型腈水合酶既能催化脂肪族腈類化合物又能催化芳香族腈類化合物，所以以鈷型腈水合酶α亞基的保守氨基酸序列為分子探針，在生物信息數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行鈷型腈水合酶基因的搜索。根據(jù)已報(bào)道的能催化CPIN的腈水合酶基因，選擇了10個(gè)腈水合酶基因，通過(guò)PCR擴(kuò)增技術(shù)獲得目標(biāo)基因片段，實(shí)現(xiàn)了其在E.coli中的可溶性表達(dá)，構(gòu)建了一個(gè)包含10個(gè)不同來(lái)源腈水合酶

4、的小型酶庫(kù)。以CPIN為底物，對(duì)酶庫(kù)進(jìn)行篩選，這10個(gè)腈水合酶對(duì)底物均有催化活性，其中來(lái)自于Klebsiella oxytoca KCTC1686腈水合酶NHaseK的催化活力最高(71.2±7.37 U/g DCW)，是已報(bào)道腈水合酶活力的2.1倍。因此選取該酶來(lái)做進(jìn)一步的研究。
　　(2)腈水合酶的高效功能表達(dá)。腈水合酶NHaseK由蛋白分子量分別為22.3kDa和24.0 kDa的α-和β-亞基構(gòu)成，實(shí)驗(yàn)證明了17K是NHa

5、seK的活化元件且對(duì)NHaseK的功能表達(dá)具有重要影響。當(dāng)NHaseK的結(jié)構(gòu)基因和17K基因以串聯(lián)形式進(jìn)行表達(dá)時(shí)，NHaseK的比活和總酶活分別為0.48 U/mg蛋白和120.1 U/L發(fā)酵液，但17K的表達(dá)量卻非常低。為了提高17K的表達(dá)量和NHaseK的酶活，對(duì)表達(dá)元件進(jìn)行了重新設(shè)計(jì)。當(dāng)在17K基因的5'端引入一個(gè)高效SD序列(5'-AAGGAG-3')后，17K的表達(dá)量有了明顯改善，NHaseK的比活和總酶活分別提高了56％和5

6、0％，達(dá)到0.75 U/mg蛋白和180.6 U/L發(fā)酵液。用Ni-親和層析的方法純化了NHaseK，并對(duì)其酶學(xué)特性進(jìn)行了研究。NHaseK的最適反應(yīng)pH為6.5，最適反應(yīng)溫度為35℃，在35℃以下具有較好的熱穩(wěn)定性;NHaseK的底物譜較廣且具有S-型立體選擇性，當(dāng)其催化CPIN時(shí)，E值為17。因此，NHaseK在一些重要酰胺化合物的制備中具有很好的應(yīng)用前景。
　　(3)酰胺酶KamH的高效功能表達(dá)。目前酰胺酶的重組表達(dá)，往往會(huì)

7、形成包涵體或無(wú)活性的蛋白。酰胺酶基因通常和腈水合酶基因相偶聯(lián)處于一個(gè)基因簇中，通過(guò)基因組信息分析，發(fā)現(xiàn)在選定的10種微生物基因組中均存在假設(shè)酰胺酶基因。通過(guò)PCR擴(kuò)增技術(shù)獲得這10個(gè)酰胺酶基因，用常規(guī)方法來(lái)進(jìn)行重組表達(dá)，結(jié)果有大量包涵體生成且可溶蛋白也沒(méi)有催化活性。與酰胺酶KamH相偶聯(lián)的腈水合酶NHaseK具有最高的酶活力，因此選取KamH來(lái)進(jìn)行高效功能表達(dá)研究，更換不同的質(zhì)粒載體、培養(yǎng)基組成和誘導(dǎo)表達(dá)條件，KamH的表達(dá)效果均沒(méi)獲得

8、明顯改善。當(dāng)用腸激酶將重組KamH酶蛋白N端的融合多肽切除之后，酶活力獲得了部分恢復(fù)(4.2±0.25 U/L)。當(dāng)以原生肽形式來(lái)進(jìn)行重組表達(dá)時(shí)，KamH實(shí)現(xiàn)了可溶性表達(dá)且酶活達(dá)到35.6±1.61 U/L。N端融合的多肽不僅影響了KamH的可溶性表達(dá)，也影響了酶蛋白的催化活性。當(dāng)以原生肽形式重組表達(dá)來(lái)源于Agrobacterium tumefaciens d3的酰胺酶DamH和來(lái)源于Rhodococcuserythropolis st

9、rain MP50的酰胺酶MamH時(shí)，同樣實(shí)現(xiàn)了高效功能表達(dá)，其酶活分別為22.9±1.55 U/L和27.4±1.69 U/L。這表明，以原生肽形式表達(dá)法來(lái)實(shí)現(xiàn)酰胺酶的高效功能表達(dá)具有一定的通用性，這為酰胺酶的重組表達(dá)提供了一個(gè)可供選擇的方法。
　　(4)酰胺酶KamH產(chǎn)酶條件優(yōu)化及酶學(xué)特征研究。首先優(yōu)化了培養(yǎng)基組成和誘導(dǎo)表達(dá)條件，在最優(yōu)條件下發(fā)酵產(chǎn)酶，重組amH的酶活達(dá)到65.8±1.82 U/L，比初始發(fā)酵酶活提高了84.8

10、％。之后對(duì)KamH的酶學(xué)特性進(jìn)行了研究，KamH的最適反應(yīng)pH為8.0，最適反應(yīng)溫度為40℃，在30℃以下具有較好的熱穩(wěn)定性;KamH的底物譜較廣，在催化外消旋酰胺時(shí)展示出嚴(yán)格的S-型立體選擇性（產(chǎn)物e.e.值＞95％）;用KamH來(lái)拆分CPIAm，在底物轉(zhuǎn)化率接近50％時(shí)，產(chǎn)物e.e.值為97.5％，E＞200。這表明KamH在精細(xì)化學(xué)品和醫(yī)藥中間體行業(yè)中具有較好的應(yīng)用前景。在進(jìn)化樹(shù)中，KamH和AS家族酰胺酶處于同一個(gè)分支中;Kam

11、H的氨基酸序列中含有AS家族酰胺酶特有的保守序列GGSSSGS和催化三聯(lián)體Ser-cis Ser-Lys，催化三聯(lián)體在KamH氨基酸序列中的位置為K96-S171-S195，這表明KamH屬于酰胺酶家族分類中的AS家族。
　　(5)一菌多酶共表達(dá)體系的構(gòu)建。構(gòu)建了兩類一菌多酶共表達(dá)體系，實(shí)現(xiàn)了腈水合酶NHaseK和酰胺酶KamH的共表達(dá)。首先構(gòu)建了三個(gè)單質(zhì)粒共表達(dá)體系，pETDuet-N-K、pRSFDuet-N-K和pCDFDu

12、et-N-K，其中以pETDuet-N-K的表達(dá)情況最好，NHaseK和KamH的酶活力分別為46.4±2.52U/L和20.3±1.35U/L。然后又構(gòu)建了三個(gè)雙質(zhì)粒共表達(dá)體系，pETDuet-N-A、pRSFDuet-N-A和pCDFDuet-N-A，其中以pETDuet-N-A的蛋白表達(dá)情況最好，NHaseK和KamH的酶活力分別為52.8±2.64U/L和22.9±1.48 U/L。兩種共表達(dá)體系相比之下，雙質(zhì)粒共表達(dá)的效果要優(yōu)