甜菜亞硝酸還原酶(NiR)基因的克隆及其表達(dá)分析.pdf

1、甜菜是我國(guó)北方特有的糖料作物,在我國(guó)北方農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中占有重要地位。其產(chǎn)量?jī)H次于甘蔗,甜菜糖占世界食糖總量的30％左右。在世界產(chǎn)糖大國(guó)中,我國(guó)是少數(shù)既產(chǎn)甜菜糖又產(chǎn)甘蔗糖的國(guó)家之一,我國(guó)甜菜的種植面積最高年份達(dá)67萬公頃,居世界第3位,總產(chǎn)量居世界第6位。然而,目前黑龍江省乃至全國(guó)甜菜單產(chǎn)不高、總產(chǎn)不穩(wěn),特別是含糖率呈下降趨勢(shì),已成為限制我國(guó)甜菜糖業(yè)發(fā)展的障礙性因子。究其原因,除品種選育滯后外,氮素供應(yīng)不合理是主要原因之一。由于氮源和氮素代謝

2、在作物產(chǎn)量中發(fā)揮著中心作用,確定氮素狀態(tài)調(diào)控的基因網(wǎng)絡(luò),鑒定重要基因的功能,闡明該基因表達(dá)蛋白生化特性,將對(duì)農(nóng)業(yè)發(fā)展有著廣泛的影響。在甜菜所需的全部營(yíng)養(yǎng)中,氮素是影響產(chǎn)量的最關(guān)鍵、最活躍因素,氮素過量會(huì)造成甜菜產(chǎn)糖量的降低。硝態(tài)氮(NO3-)是旱田作物可利用氮素的主要形式,NR是NO3-無機(jī)同化的限速酶,NiR是NO3-無機(jī)同化的控制酶。與NR相比較,有關(guān)NiR研究尚少。
　　 亞硝酸還原酶(NiR)是氮素同化途徑的關(guān)鍵酶,由于

3、NiR活力一般要比NR活力高得多,所以NiR作為硝酸鹽還原的限制步驟的可能性就被排除了,致使國(guó)內(nèi)外以往的初級(jí)氮素同化研究忽略了NiR的控制酶作用,造成氮的無機(jī)同化代謝研究偏重于NR的不平衡局面。本研究借助現(xiàn)代分子生物學(xué)手段,首次克隆甜菜亞硝酸還原酶編碼基因的eDNA全長(zhǎng)序列以及基因組gDNA全長(zhǎng)序列;首次確定了甜菜亞硝酸還原酶基因編碼蛋白的多肽序列和功能區(qū)域;首次推測(cè)出甜菜亞硝酸還原酶蛋白的3D構(gòu)象;并通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法(RT

4、-PCR),在轉(zhuǎn)錄水平上研究該基因在NO3-N和NH4+-N兩種不同形態(tài)氮素條件下以及NO3-N和NH4+-N分別處理不同濃度下的表達(dá)變化,揭示氮素條件和甜菜NiR基因表達(dá)的關(guān)系;另外在氮素誘導(dǎo)的基礎(chǔ)上,設(shè)置不同濃度蛋白抑制劑放線菌酮處理,以及NO2-處理和NaCl處理,研究甜菜NiR基因的表達(dá);初步研究了環(huán)境因子對(duì)于亞硝酸還原酶基因表達(dá)的影響。具體的研究?jī)?nèi)容和結(jié)論如下:
　　 1.根據(jù)GenBank已知甜菜部分DNA序列(AF

5、173663)和菠菜mRNA(X07568)全長(zhǎng)序列,進(jìn)行同源比對(duì),在保守區(qū)設(shè)計(jì)巢式PCR引物,利用RACE方法擴(kuò)增得到甜菜亞硝酸還原酶基因的5'和3'未知區(qū)域。
　　 2.依據(jù)得到的5'和3'序列設(shè)計(jì)引物,擴(kuò)增得到中間片段P0。
　　 3.將5'端和3'端以及中間片段PO進(jìn)行拼接,以拼接序列設(shè)計(jì)引物,成功地從甜菜葉片中首次分離了NiR的全長(zhǎng)基因,登錄號(hào)為HQ224499,長(zhǎng)度為2014bp。該序列含有一個(gè)長(zhǎng)度1830b

6、p的開放讀碼框(ORF),編碼599個(gè)氨基酸,經(jīng)BLAST分析,核苷酸序列及其推導(dǎo)的氨基酸序列與其它植物NiR基因具有較高的同源性。
　　 4.運(yùn)用PCR擴(kuò)增技術(shù)首次克隆了甜菜NiR基因組序列,登錄號(hào)為HQ419065,測(cè)序結(jié)果表明,基因組DNA長(zhǎng)度為2815bp,含有4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子,內(nèi)含子長(zhǎng)度分別為531bp,135bp和269bp;4個(gè)外顯子長(zhǎng)度分別為437bp,355bp,289bp和799bp。
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7、.采用TopPred在線工具分析了NiR的理化特性,并構(gòu)建了NiR的系統(tǒng)發(fā)育樹,結(jié)果表明,甜菜NiR為易溶、親水性強(qiáng)的蛋白,理論等電點(diǎn)pI為7.21,相對(duì)分子量為66.88kDa,該蛋白C端存在一個(gè)跨膜區(qū)。甜菜NiR與菠菜(Spinaciaoleracea)NiR的親緣關(guān)系最近。二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示,NiR包含29.05％的螺旋,21.04％的延伸鏈和49.92％的自由卷曲。卷曲結(jié)構(gòu)和螺旋結(jié)構(gòu)是甜菜NiR的二級(jí)結(jié)構(gòu)的主體。另外,應(yīng)用同源

8、建模法進(jìn)行NiR三維結(jié)構(gòu)的預(yù)測(cè),3D結(jié)構(gòu)包括352個(gè)H-bonds:21個(gè)Helices;30處Strands;66個(gè)Turns。
　　 6.分析甜菜NiR基因編碼蛋白的結(jié)構(gòu)域,所推導(dǎo)的氨基酸序列具有完整NiR結(jié)構(gòu),含血紅素蛋白β-化合物區(qū)域(hemoproteinbeta-component,ferrodoxin-like,Domain:氨基酸133～203,氨基酸392～461),4Fe-4S區(qū)域(4Fe-4Sregion,

9、Domain:氨基酸211～371,氨基酸517～580)。甜菜NiR沒有信號(hào)肽,是非分泌型蛋白。甜菜NiR氨基酸序列的517～533區(qū)域的TGCpns Cgqvqva DIGF為NiR的活性位點(diǎn)。
　　 7.實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示,在以0、10、20、30、40、50、80和160mmolL-1NO3--N處理72h的試驗(yàn)中,50mmolL-1處理可使甜菜NiR的表達(dá)量達(dá)到最大:以0、2、4、8、16、32、64和128m