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1、(R)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯(R-CHBE)是用于制備手性藥物的前體,包括臨床上用于降低膽固醇的3-羥基-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶抑制劑(他汀類)。不對稱還原反應(yīng)4-氯-3-酮基丁酸乙酯(COBE)生成(R)-4-氯-3-羥基丁酸乙酯主要通過生物催化來完成,生物催化具有成本低、反應(yīng)條件溫和、產(chǎn)率高以及對映體選擇性等優(yōu)點。
生物合成(R)-CHBE的主要過程一般為:第一步,篩選適合催化還原COBE→(R)-CHBE的微生物
2、;第二步,基因克隆、表達(dá)和酶性質(zhì)鑒定;第三步,輔酶再生系統(tǒng)的構(gòu)建;第四步,通過重組菌來生物催化COBE至(R)-CHBE。
本論文從路德酵母基因組中克隆獲得新型酮基還原酶基因(Ketoreductase,KR),在酵母菌中得到高效表達(dá)。KR作為 NADPH依賴型的酮基還原酶,這種酶催化COBE的最適溫度為30℃,最適pH為6.0。為了降低反應(yīng)成本,適應(yīng)大規(guī)模工業(yè)生產(chǎn),本論文進(jìn)一步研究了酮基還原酶KR催化COBE合成產(chǎn)物(R)-
3、CHBE的不對稱還原反應(yīng)中輔酶的再生循環(huán)。在GS115中通過構(gòu)建酮基還原酶和葡萄糖脫氫酶共表達(dá)重組菌株,利用葡萄糖脫氫酶偶聯(lián)反應(yīng),即催化葡萄糖氧化為葡萄糖酸反應(yīng)的同時還原NADP+為NADPH進(jìn)行輔酶再生。為優(yōu)化NADPH再生系統(tǒng),將酮基還原酶KR和葡萄糖脫氫酶GDH基因分別構(gòu)建到質(zhì)粒pETDUET后,轉(zhuǎn)化到表達(dá)宿主菌BL21(DE3)中。以23 mM COBE和99 mM葡萄糖為底物,經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)的重組菌細(xì)胞為催化劑,反應(yīng)5.5h后,反
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