黃曲霉毒素B1對黃河鯉魚的免疫毒性及其干預(yù)劑研究.pdf

1、黃曲霉毒素（AFB1）是當(dāng)前發(fā)現(xiàn)的毒性和致癌性最強(qiáng)的化學(xué)物質(zhì)之一，其中以AFB1的毒性最強(qiáng)。水產(chǎn)飼料中使用植物成分以及加工或貯存過程控制不當(dāng)就會容易被黃曲霉毒素污染。本文系統(tǒng)研究了AFB1對黃河鯉魚的急性毒性及慢性毒性：對黃河鯉魚生長性能及生理生化指標(biāo)的影響，對鯉魚非特異性免疫酶活的影響，對鯉魚 IL-1β、TNF-α以及Lysozyme-C等免疫相關(guān)基因表達(dá)的影響，對鯉魚Bcl-2、Bax及 Caspase-3等細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)的

2、影響，組織病理學(xué)分析以及毒素在黃河鯉魚組織中的積累。同時通過體外細(xì)胞培養(yǎng)研究了香菇葡聚糖 CED對 AFB1誘導(dǎo)的黃河鯉魚淋巴細(xì)胞免疫毒性的保護(hù)作用，制備納米化肉桂醛并研究了其抑制黃曲霉菌生長及產(chǎn)毒活性。最后通過動物學(xué)實(shí)驗(yàn)等驗(yàn)證了CED、納米化肉桂醛等作為水產(chǎn)飼料中AFB1干預(yù)劑使用的作用效果。
　　本研究主要內(nèi)容包括：⑴通過腹腔注射測得AFB1對黃河鯉魚半致死劑量為12.3mg/kg體重，95％置信區(qū)間12.2-25.5mg/k

3、g體重。隨著注射AFB1濃度的升高，黃河鯉魚血液中細(xì)胞呼吸爆發(fā)活性、免疫球蛋白 IgM、堿性磷酸酶呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢；溶菌酶活性、血漿總蛋白、白蛋白含量降低；谷丙轉(zhuǎn)氨酶活性、谷草轉(zhuǎn)氨酶活性、補(bǔ)體3含量升高。經(jīng)6.1mg/kgAFB1處理，鯉魚肝臟SOD活性下降了11%，GSH含量下降了38%，MDA含量提高了28%，差異顯著（P<0.05）。AFB1抑制了頭腎、脾臟中IL-1β、TNF-α以及Lysozyme-C三個免疫相關(guān)基因的表

4、達(dá)。表明AFB1一定程度上抑制了黃河鯉魚機(jī)體免疫防御，誘導(dǎo)其肝臟發(fā)生氧化損傷。⑵通過90天不間斷飼喂含AFB1的飼料，發(fā)現(xiàn)黃河鯉魚表現(xiàn)出食欲下降、消瘦、活動減弱現(xiàn)象。1 mg/kg AFB1處理組鯉魚增重率下降50%，飼料系數(shù)為對照組的2倍。鯉魚的肥滿度、肌肉必需氨基酸總量略有下降，差異不顯著(P<0.05)。攝入1 mg/kg AFB1鯉魚肝胰臟中AFB1含量高達(dá)6.1μg/kg，肌肉中AFB1含量卻都低于0.5μg/kg。通過石蠟切

5、片發(fā)現(xiàn)，鯉魚肝臟、頭腎、后腎、十二指腸等器官發(fā)生不同程度的病變。通過免疫組化分析發(fā)現(xiàn)，肝臟、腎臟細(xì)胞Bcl-2表達(dá)受到抑制，Bax表達(dá)升高，Bcl-2/Bax下降，Caspase-3表達(dá)升高。表明AFB1能夠誘導(dǎo)黃河鯉魚肝臟、腎臟細(xì)胞凋亡。⑶研究發(fā)現(xiàn)10、50μg/mL CED對黃曲霉菌產(chǎn)毒的抑制率分別達(dá)到70%、92%，而100、250、500μg/mL的CED對黃曲霉菌產(chǎn)毒的抑制率均達(dá)到100%。通過體外離體培養(yǎng)誘導(dǎo)方法，發(fā)現(xiàn)20μ

6、g/L AFB1能夠顯著抑制鯉魚淋巴細(xì)胞活性，導(dǎo)致淋巴細(xì)胞內(nèi)ROS水平、MDA水平顯著升高（P<0.05）；能夠抑制淋巴細(xì)胞內(nèi)的SOD、CAT、GSH活性，降低膜電位水平，誘導(dǎo)淋巴細(xì)胞崩潰。100μg/mLCED處理，可以有效提高淋巴細(xì)胞活性，降低胞內(nèi)ROS、MDA水平，增強(qiáng)SOD、CAT酶活。CED可以有效抑制AFB1誘導(dǎo)的淋巴細(xì)胞線粒體膜電位崩解狀態(tài)，提高淋巴細(xì)胞活性，增強(qiáng)鯉魚免疫細(xì)胞的抗氧化防御系統(tǒng)。⑷通過制備納米化肉桂醛，提高了

7、肉桂醛的溶解性、穩(wěn)定性以及對黃曲霉菌的抑制效果。選擇乙酸乙酯作為油相，無水乙醇為助表面活性劑，吐溫-80作為表面活性劑，Km=2:1（吐溫-乙醇質(zhì)量比值），制備的納米化肉桂醛，形成了均一、穩(wěn)定、透明的水溶性體系。納米化肉桂醛在終濃度為0.6 mM時，可以有效地抑制黃曲霉菌菌絲生長，與肉桂醛相比，抑菌活性提高了50-100%。Nano-CA能夠?qū)е曼S曲霉菌孢子發(fā)生更強(qiáng)烈的鈣離子外流。雖然1mM肉桂醛也能夠有效抑制黃曲霉孢子生長，但低濃度的

8、肉桂醛（沙氏培養(yǎng)基中0.2mM、花生醬中0.25mM）一定程度上能夠促進(jìn)AFB1的產(chǎn)生。因此在黃曲霉毒素污染控制上，納米化肉桂醛比肉桂醛更有效果。⑸10mg/kg、50mg/kgCED作為飼料中AFB1干預(yù)劑，能提高鯉魚的增重率、鯉魚含肉率及降低飼料系數(shù)；一定程度上提高細(xì)胞呼吸爆發(fā)活性、溶菌酶活性、堿性磷酸酶（AKP）活性、IgM含量、C3含量，降低血清中ALT及AST活性。表明CED作為飼料添加劑可以有效降低AFB1對黃河鯉魚的毒害作