抗菌肽SMAP-29基因的設(shè)計、合成、表達純化及抗菌活性的檢測.pdf

1、目的:
　　通過設(shè)計合成抗菌肽SMAP-29新基因,構(gòu)建其原核表達載體pGEX-4T-1/SMAP-29,經(jīng)誘導表達和分離純化,得到大量具有抗菌活性的抗菌肽SMAP-29。
　　方法:
　　根據(jù)SMAP-29蛋白質(zhì)氨基酸序列,選用大腸桿菌偏愛密碼子,同時兼顧了其 mRNA二級結(jié)構(gòu)自由能自行設(shè)計全新基因,基因采用 geneSOEing(gene splicing by overlap extension, geneSOE

2、ing)法合成,合成的基因克隆至pGEX-4T-1原核表達載體中,通過酶切分析、PCR和測序鑒定篩選出陽性重組質(zhì)粒;重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21(DE3)中進行IPTG誘導表達,經(jīng)GST瓊脂糖FF層析柱純化,同時作凝血酶切割,再經(jīng) HPLC分離純化,獲得純度達95％的目的蛋白。檢測抗菌肽 SMAP-29的抗菌活性,采用微量肉湯稀釋法測定其對白色葡萄球菌(臨床株)、糞腸球菌耐藥株(耐氟喹諾酮類)、糞腸球菌標準株(ATCC29212)和大

3、腸桿菌(JM109)的MIC和MBC值。
　　結(jié)果:
　　經(jīng)geneSOEing法合成的全新基因長109bp(含限制性酶切位點),將其克隆至pGEX-4T-1原核表達載體中,通過酶切分析、PCR和測序鑒定,其序列與所設(shè)計序列完全一致。SDS-PAGE電泳結(jié)果分析表明 pGEX-4T-1/SMAP-29可以在BL21中表達大小約29KD的GST-SMAP-29融合蛋白,經(jīng)凝血酶切割和分離純化后得到大小約3.2KDa的SMAP-