β-TCP-HIF-1α緩釋復(fù)合體對預(yù)血管化膜片內(nèi)皮血管網(wǎng)形成的影響.pdf

1、目的：本研究欲將不同濃度下的缺氧誘導(dǎo)因子-1α（hypoxia induced factor-1α,HIF-1α）和支架材料β-磷酸三鈣（β-tricalcium phosphate,β-TCP）復(fù)合形成緩釋復(fù)合體。一方面，研究不同濃度下的β-TCP\HIF-1α緩釋復(fù)合體對人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)的招募和遷移作用；另一方面，基于預(yù)血管化的細(xì)胞膜片技術(shù)

2、（cell sheet technology,CST），研究不同濃度下的β-TCP\HIF-1α緩釋復(fù)合體對內(nèi)皮血管網(wǎng)形成的作用和影響，以期為優(yōu)化構(gòu)建穩(wěn)定而豐富的三維預(yù)血管化網(wǎng)絡(luò)的工程骨組織提供進(jìn)一步的理論指導(dǎo)。
　　方法：(1)β-TCP\HIF-1α緩釋復(fù)合體的構(gòu)建：將HIF-1α配成濃度為50，100，200mg/L的溶液，無菌過濾分裝。將高溫高壓烘干后的β-TCP支架材料放入HIF-1α溶液中浸泡備用（浸泡3天）；HIF-

3、ELISA試劑盒用于各實(shí)驗(yàn)組不同時(shí)間點(diǎn)緩釋能力的檢測。（2）HUVECs遷移實(shí)驗(yàn)和預(yù)血管化的fBMSCs膜片的構(gòu)建：胎兒骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(fetal bone marrow mesenchymal stem cell,fBMSCs)和HUVECs的培養(yǎng)擴(kuò)增；Transwell遷移實(shí)驗(yàn)檢測不同濃度梯度下的β-TCP\HIF-1α緩釋復(fù)合體（0，50，100，200mg/L）和單純100mg/L的HIF-1α對HUVECs的招募和遷移，經(jīng)染

4、色處理、顯微拍照后軟件計(jì)數(shù)，統(tǒng)計(jì)學(xué)分析各組差異性。將fBMSCs按9×104個(gè)/cm2的密度置于六孔板內(nèi)進(jìn)行成膜培養(yǎng)14天（fBMSCs膜片）；HUVECs按5×104個(gè)/cm2的密度播種至fBMSCs膜片上進(jìn)行體外預(yù)血管化的構(gòu)建；大體觀、顯微鏡觀察獲取膜片特征。（3）β-TCP\HIF-1α緩釋復(fù)合體對預(yù)血管化的fBMSCs膜片內(nèi)皮血管網(wǎng)形成的影響：將單純的β-TCP支架組、β-TCP\HIF-1α緩釋組（50，100，200mg/L

5、）和100mg/L的單純HIF-1α因子組，分別放入育有預(yù)血管化的fBMSCs膜片的六孔板中，分別在實(shí)驗(yàn)的第1，3，7，14天進(jìn)行CD31免疫熒光染色檢測，觀察不同實(shí)驗(yàn)組中內(nèi)皮血管網(wǎng)形成的情況。
　　結(jié)果：（1）β-TCP\HIF-1α緩釋復(fù)合體均在第三天緩釋濃度達(dá)到高峰，后期逐漸降低；21天后，各組的累積釋放率均>85％。（2）fBMSCs呈長梭形、HUVECs呈“鋪路石”般卵圓形。fBMSCs經(jīng)14天連續(xù)培養(yǎng)可形成一層完整而菲

6、薄的fBMSCs膜片，邊緣向內(nèi)卷曲，可用鑷子沿邊緣提起。（3）Transwell實(shí)驗(yàn)證實(shí)HIF-1α具有體外招募和遷移HUVECs的作用，且以100mg/L HIF-1α組作用最為顯著（P<0.05）。(4)β-TCP\HIF-1α緩釋復(fù)合體對預(yù)血管化的fBMSCs膜片內(nèi)皮血管網(wǎng)形成的影響結(jié)果顯示，200mg/L的β-TCP\HIF-1α緩釋復(fù)合體組(第7天)和100mg/L的HIF-1α組（第3天）形成的預(yù)血管化網(wǎng)絡(luò)數(shù)量最多（P<0.