食源性蠟樣芽孢桿菌毒力基因調(diào)研及基于aPCR裸眼檢測(cè)方法的研究.pdf

1、蠟樣芽孢桿菌是一種食源性的條件致病菌，廣泛分布于空氣、土壤、污水以及各類生、熟食品及食品原料中。該菌引起的食物中毒癥狀主要表現(xiàn)為嘔吐和腹瀉。嘔吐型中毒主要由嘔吐毒素引起，而腹瀉型則為多種腸毒素的作用。目前在我國(guó)食品安全相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)中，對(duì)蠟樣芽孢桿菌的限量值并沒有明確規(guī)定，致使食品生產(chǎn)過(guò)程中對(duì)該菌的控制無(wú)法可依。因此，有必要了解食品中蠟樣芽孢桿菌的潛在毒性及威脅，同時(shí)建立快速且準(zhǔn)確的檢測(cè)方案對(duì)其進(jìn)行監(jiān)控。本文對(duì)食源性蠟樣芽孢桿菌中兩類毒力基因

2、的分布和其中四種腸毒素基因在食品基質(zhì)中相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行了研究，并建立了基于不對(duì)稱PCR（aPCR）的納米金比色法對(duì)產(chǎn)嘔吐毒素蠟樣芽孢桿菌進(jìn)行檢測(cè)。各章內(nèi)容分述如下：
　　第一章綜述了有關(guān)蠟樣芽孢桿菌及aPCR技術(shù)的研究進(jìn)展。
　　第二章探究了食源性蠟樣芽孢桿菌中嘔吐毒素基因和腸毒素基因的分布，并對(duì)四種腸毒素基因在食品基質(zhì)中的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行了分析。本研究采用PCR技術(shù)對(duì)江西省各類食品中分離到的132株蠟樣芽孢桿菌中兩類毒力基

3、因進(jìn)行了檢測(cè)。結(jié)果表明，132株蠟樣芽孢桿菌中，2株攜帶有嘔吐毒素基因，檢出率為1.5％；130株攜帶有腸毒素基因，檢出率為98.5%。在攜帶腸毒素基因的菌株中，entFM、nheA、cytK和hblD的檢出率分別為99%、92%、71%和43%。此外，125株同時(shí)攜帶兩種或以上腸毒素基因，檢出率為96%，其中同時(shí)檢出攜帶2種、3種和4種腸毒素基因的分離株分別為34株、44株和47株。在了解毒力基因分布情況的基礎(chǔ)上，本研究進(jìn)一步對(duì)四種腸

4、毒素基因在不同食品中的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行了分析。通過(guò)檢測(cè)不同生長(zhǎng)時(shí)期菌體的菌濃度，繪制不同基質(zhì)中蠟樣芽孢桿菌生長(zhǎng)曲線，分別在達(dá)到對(duì)數(shù)后期時(shí)收集菌體提取細(xì)菌總RNA，以gatB_Yqey作為內(nèi)參基因，采用反轉(zhuǎn)錄-熒光定量PCR技術(shù)，探究4種腸毒素基因在米飯、面條、奶粉和米粉中的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果表明：腸毒素基因的相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平與菌株、基因類型和培養(yǎng)基質(zhì)相關(guān)。4種腸毒素基因間其相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平存在顯著差異。對(duì)于cytK和nheA，其相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平受食

5、品基質(zhì)和菌株的影響；而對(duì)于hblD和entFM，其相對(duì)轉(zhuǎn)錄水平主要受食品基質(zhì)的影響，且大部分呈下調(diào)。
　　第三章建立了PMA-aPCR-AuNPs方法檢測(cè)產(chǎn)嘔吐毒素蠟樣芽孢桿菌活菌。該方法采用PMA進(jìn)行前處理以消除死菌DNA帶來(lái)的假陽(yáng)性結(jié)果，利用aPCR方法特異性地?cái)U(kuò)增出單鏈DNA（ssDNA），通過(guò)ssDNA組分中暴露的氮原子與納米金的Au原子發(fā)生相互配位作用，使ssDNA有效地吸附在納米金表面，保護(hù)納米金，防止其在鹽溶液中發(fā)生

6、聚集，通過(guò)觀察溶液顏色的變化，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)對(duì)產(chǎn)嘔吐毒素蠟樣芽孢桿菌活菌的檢測(cè)。結(jié)果表明：PMA能有效消除107 CFU/mL死菌DNA的PCR擴(kuò)增，而對(duì)活菌DNA沒有影響；ssDNA與雙鏈DNA（dsDNA）均能具有保護(hù)鹽溶液中納米金粒子的作用，但ssDNA保護(hù)效果顯著優(yōu)越于dsDNA；該方法在純培養(yǎng)物和牛奶加標(biāo)樣本中的檢測(cè)限分別為9.2×101 CFU/mL和3.4×102 CFU/mL，且對(duì)牛奶中8種常見的致病菌進(jìn)行檢測(cè)均表現(xiàn)出較好的特