實(shí)時(shí)熒光環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)檢測牛奶中蠟樣芽孢桿菌的研究.pdf

1、近年來，隨著我國食品行業(yè)的飛速發(fā)展，食品的數(shù)量和種類都得到了突飛猛進(jìn)的增長，但病原菌引起的食物中毒事件接連發(fā)生，當(dāng)前我國常規(guī)微生物檢測方法檢測耗時(shí)長，步驟繁瑣、靈敏度低，難以滿足檢測的需求。在致病菌中其中蠟樣芽孢桿菌生長條件寬松，生存范圍廣，極易污染食物，特別是肉、蛋、奶和它們制成的食品，被人誤食后極易引起食物中毒，是人類的一種重要的食源性病原菌。當(dāng)前，對(duì)蠟樣芽孢桿菌的檢測，我國通常使用傳統(tǒng)的國標(biāo)法，此方法雖然檢測結(jié)果可靠，但是該試驗(yàn)法

2、在操作步驟繁多，檢測出結(jié)果的時(shí)間長，而新型的快速檢測方法，如免疫學(xué)方法，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，生物傳感器技術(shù)等等都或多或少存在檢測成本高，結(jié)果不可靠，或者是對(duì)操作人員專業(yè)素質(zhì)要求高等等因素，導(dǎo)致了這些方法不能打規(guī)模推廣使用。
　　Notomi T.等人在2000年研發(fā)出了環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（LAMP），在恒溫條件下的高效擴(kuò)增反應(yīng)，幾十分鐘即可完成，其擴(kuò)增產(chǎn)物既可通過電泳檢測，也可以通過加入染料SYBY GreenⅠ后再用肉眼判定結(jié)果和焦

3、磷酸鎂濁度檢測。實(shí)時(shí)熒光環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增反應(yīng)是在LAMP的基礎(chǔ)上發(fā)展的一種新的檢測技術(shù)?；贚AMP反應(yīng)上的優(yōu)點(diǎn)，改進(jìn)了LAMP的缺陷。本研究是根據(jù)LAMP的反應(yīng)原理，在反應(yīng)體系添加熒光染料，通過反應(yīng)產(chǎn)物與熒光染料結(jié)合發(fā)出熒光的特點(diǎn)，利用實(shí)時(shí)熒光監(jiān)測儀(ESE-Quant Tube Scanner)進(jìn)行實(shí)時(shí)的監(jiān)控，建立實(shí)時(shí)熒光環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(Real-Time Fluorescence Loop-Mediated Isothermal

4、 Amplication，簡稱RealAmp)檢測蠟樣芽孢桿菌的方法。
　　本研究基于蠟樣芽孢桿菌的hblA基因序列，利用在線引物設(shè)計(jì)軟件Primer V4設(shè)計(jì)四條特異性引物。通過體系優(yōu)化包括Mg2+的添加量、dNTPs的濃度、Bst DNA聚合酶、引物的添加量及內(nèi)外引物的比例等，擴(kuò)增條件優(yōu)化優(yōu)化了反應(yīng)溫度，利用實(shí)時(shí)檢測儀監(jiān)測反應(yīng)進(jìn)程并給出監(jiān)測結(jié)果。最終優(yōu)化的反應(yīng)體系:外引物F3與B3各0.5μL，內(nèi)引物BIP與FIP2.5μL，

5、MgSO4終濃度1.0 mM，0.3mM dNTPs，10×TheromoPol Reaction Buffer2.5μL，BstDNA聚合酶(8000U)1.5μL，DNA模板2μL，甜菜堿0.5μL，熒光染料0.5μL，ddH2O補(bǔ)足體積到25μμL。擴(kuò)增反應(yīng)條件:63℃反應(yīng)80min。
　　通過21株致病菌驗(yàn)證RealAmp特異性，結(jié)果表明4株蠟樣芽孢桿菌結(jié)果顯示陽性，而其他17株非蠟樣芽孢桿菌結(jié)果顯示均為陰性，說明該試驗(yàn)方