云南大葉種茶樹多酚氧化酶的分離純化與性質(zhì)研究.pdf

1、多酚氧化酶(Polyphenol oxidase，PPO)是紅茶品質(zhì)形成的關(guān)鍵因素，為此本課題選用PPO活性較高的“云大”鳳慶種鮮葉為材料，經(jīng)提取、分離純化，得到兩條PPO同工酶，并分別做了較全面的酶學(xué)特性研究。具體結(jié)果如下:
　　(1)依據(jù)酶活力、Native-PAGE電泳圖等，優(yōu)化確定鳳慶PPO最佳提取條件:取適量茶鮮葉，以料液比1∶3(W/V)加入4℃預(yù)冷的檸檬酸鹽緩沖液(0.1 mol/L，pH7.2)，和5％(g/mL)

2、 PVP冰浴研磨，漿液4℃浸提12h，9000 r/min，4℃離心30 min，取上清，得PPO粗酶液。
　　(2)制備的鳳慶PPO粗酶液，經(jīng)硫酸銨分級沉淀、離子交換層析（DEAE-SepharoseCL-6B）和凝膠過濾層析(Sephadex G-150)，分離純化得到2條同工酶:PPOⅠ，約35 kDa的單一蛋白亞基，純化倍數(shù)19.45; PPOⅡ，55-66.2 kDa的兩個蛋白亞基結(jié)合體，純化倍數(shù)30.18。
　　

3、(3) PPO同工酶性質(zhì)分析（以鄰苯二酚為底物）:PPOⅠ和Ⅱ的最適反應(yīng)溫度均為40℃，最適pH分別為5.2、5.6，最適Cu2+濃度分別為0.5×10-7mol/L和1.00×10-7mol/L。抑制劑對鳳慶PPOⅠ和Ⅱ的作用強(qiáng)弱次序:抗壞血酸＞亞硫酸鈉＞EDTA＞半胱氨酸，抗壞血酸最高濃度時，酶活下降50％。鳳慶PPO最適底物是鄰苯二酚和焦沒食子酸，可部分氧化沒食子酸、對苯二酚，對間苯二酚作用最弱。酶動力學(xué)參數(shù):以鄰苯二酚為底物，P