茶樹多酚氧化酶的提取、分離純化及其部分酶性質(zhì)研究.pdf

1、多酚氧化酶(Polyphenol Oxidase，PPO)對茶樹的生理代謝和生產(chǎn)加工都有著極為重要的作用，然而目前缺少對茶樹PPO單一同工酶的研究。本課題以綠茶適制性最好的龍井43號茶樹品種為材料，通過硫酸銨分級沉淀、離子交換層析、凝膠過濾層析，分離純化得到三種PPO單一同工酶，并對PPOⅠ、PPOⅢ的酶學特性進行了研究。主要研究結果如下:
　　(1)以龍井43號茶鮮葉為材料，在不同的單因素條件下提取粗酶液，通過測定粗酶活性和非變

2、性凝膠電泳比較同工酶條帶等，確定PPO粗酶提取的最佳條件。結果表明，以料液比1∶2，加入內(nèi)含5％PVP(w/v)經(jīng)預冷的pH7.2檸檬酸-磷酸鹽緩沖液(0.15mol/L)，冰浴研磨，隔夜浸提12h，于4℃、9000r/min離心35min，取上清液，過濾制得的PPO粗酶液活性最高，出現(xiàn)5條明顯的同工酶帶。
　　(2)最佳提取條件得到的PPO粗酶，經(jīng)優(yōu)化確定以30％-80％的硫酸銨分級沉淀除去部分雜蛋白，沉淀經(jīng)超濾脫鹽濃縮，再經(jīng)過

3、DEAE Sepharose CL-6B陰離子交換層析、Sephndex G-150凝膠過濾層析純化得到三條電泳純的PPO單一同工酶(PPOⅠ、PPOⅡ、PPOⅢ)。PPOⅠ、PPOⅡ、PPOⅢ的大小分別為38kDa、48kDa和80kDa，分別被純化14.41、1.08和1.30倍，比活力為7177.0U/mg、537.45U/mg和648.22U/mg。
　　(3)酶學特性研究表明，PPOⅠ的最適pH為5.6，PPOⅢ的最適p

4、H為6.8，二者在pH5.6-7.2的范圍內(nèi)均能保持60％以上的相對酶活。PPOⅠ、PPOⅢ的最適溫度分別為30℃和35℃，25℃-40℃的溫度范圍內(nèi)，二者活性均較高;溫度超過60℃時，二者基本失活。亞硫酸鈉、半胱氨酸、抗壞血酸均對PPOⅠ、PPOⅢ有抑制作用，半胱氨酸抑制效果相對較好，低濃度的Cu2+對PPOⅠ、PPOⅢ的活性有促進作用。以鄰苯二酚為底物時，PPOⅢ對底物的親和力要強于PPOⅠ。PPOⅠ的Km值為91.34mmol/L