山藥多酚氧化酶的提取和酶學性質(zhì)研究【畢業(yè)論文】

1、<p>　　本科畢業(yè)論文（設計）</p><p>　　論文題目：山藥多酚氧化酶的提取和酶學性質(zhì)研究</p><p>　　所在學院 生物與環(huán)境學院 </p><p>　　專業(yè)班級 生物技術(shù) </p><p>　　學生姓名 學號 </

2、p><p>　　指導教師 職稱 </p><p>　　完成日期 年 月 日</p><p>　　畢業(yè)論文（設計）誠信承諾書</p><p>　　1．本人承諾所上交的畢業(yè)論文（設計），是在指導教師的指導下嚴格按照學校和學院有關(guān)規(guī)定完成的，引用他人的觀點和參考資料均

3、加以注釋和說明。</p><p>　　2．本人鄭重地承諾所上交的畢業(yè)論文（設計）沒有抄襲他人研究（設計）成果和偽造相關(guān)數(shù)據(jù)等行為。</p><p>　　3．畢業(yè)論文（設計）若有侵犯他人知識產(chǎn)權(quán)的行為，由本人承擔相應的法律責任。</p><p>　　學生簽名：__________</p><p>　　日 期：__________</

4、p><p><b>　　摘 要</b></p><p>　　多酚氧化酶（polyphenol oxidase,EC.1.10.3.1）是自然界中一類分布極廣的金屬蛋白酶，普遍存在于植物、真菌、昆蟲體內(nèi)，能催化多酚類氧化成醌類。本實驗以新鮮山藥為試驗材料，采用丙酮粉沉淀抽濾法從新鮮山藥中提取多酚氧化酶，提取的粗酶液經(jīng)20％～50％硫酸銨分級沉淀，透析除鹽，得到一種活性較高

5、的多酚氧化酶，測其蛋白含量，并對酶學性質(zhì)進行研究。用鄰苯二酚為底物，在420nm波長下，采用分光光度法測定山藥多酚氧化酶的活力。研究了pH、溫度、底物濃度和抑制劑等不同因素對山藥多酚氧化酶活力的影響。結(jié)果表明，山藥提取液中蛋白含量為0.1038mg/mL；山藥多酚氧化酶的最適pH為5.6；最適溫度為35℃；由Lineweaver-Burk 方程得到動力學參數(shù)：Km為53.76mol/L，Vmax為0.3924U，山藥多酚氧化酶熱穩(wěn)定性實

6、驗顯示，在50-100℃的溫度下水浴處理1h，酶活力均有所喪失，當溫度達到85℃時，山藥多酚氧化酶徹底失活；隨酶液濃度的變大而成直線上升趨勢；L­半胱氨酸、檸檬酸、維生素C及NaCl四種抑制劑都能達到不同程度的抑制效果。</p><p>　　關(guān)鍵詞：山藥；多酚氧化酶；褐變；酶活力；抑制劑</p><p><b>　　ABSTRACT</b></p>

7、;<p>　　Polyphenol oxidase (polyphenol oxidase,EC.1.10.3.1) is a very widely distributed tissue in nature, generally found in plants, fungi, insect, polyphenol compounds catalyzed by oxidized into Quinones. This ex

8、periment with fresh Yam for the test material, using acetone powder by precipitation filter extraction of polyphenols from fresh Yam activity, extraction of crude enzyme solution of ammonium 20%~50% fractional precipitat

9、ion, dialysis and desalting, get a high activity of polyphenol oxidase, it</p><p>　　Keywords: Dioscorea opposita; polyphenol oxidase; browning; activity; inhibitors</p><p><b>　　目 錄</b&

10、gt;</p><p><b>　　1 前言1</b></p><p><b>　　2 材料與方法2</b></p><p>　　2.1材料與試劑2</p><p><b>　　2.2儀器3</b></p><p>　　2.3山藥多酚氧化酶的提取

11、3</p><p>　　2.3.1丙酮粉的制備3</p><p>　　2.3.2山藥多酚氧化酶粗酶液的制備3</p><p>　　2.3.3硫酸銨分級沉淀3</p><p>　　2.4山藥多酚氧化酶提取液蛋白含量測定4</p><p>　　2.5山藥多酚氧化酶的活性測定4</p><p&

12、gt;　　2.6山藥多酚氧化酶酶學性質(zhì)測定5</p><p>　　2.6.1 Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖測定動力學常數(shù)5</p><p>　　2.6.2 pH值對PPO活性的影響5</p><p>　　2.6.3溫度對PPO活性的影響5</p><p>　　2.6.4 PPO的熱穩(wěn)定性測定5</p>&l

13、t;p>　　2.7抑制劑對PPO活力的影響5</p><p><b>　　3 結(jié)果與討論6</b></p><p>　　3.1硫酸銨鹽析結(jié)果6</p><p>　　3.2 PPO提取液蛋白含量及比活計算6</p><p>　　3.3 山藥PPO酶學性質(zhì)分析7</p><p>　　3

14、.3.1 Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖和動力學常數(shù)7</p><p>　　3.3.2 pH值與PPO活性的關(guān)系8</p><p>　　3.3.3 溫度與PPO活性的關(guān)系8</p><p>　　3.3.4 PPO 熱穩(wěn)定性9</p><p>　　3.4抑制劑對PPO 活性的影響9</p><p>　

15、　3.4.1檸檬酸對PPO的抑制作用10</p><p>　　3.4.2 NaCl對PPO的抑制作用10</p><p>　　3.4.3 L­半胱氨酸對PPO的抑制作用11</p><p>　　3.4.4 抗壞血酸對PPO的抑制作用12</p><p><b>　　4 結(jié)論13</b></p&g

16、t;<p><b>　　參考文獻15</b></p><p><b>　　致 謝16</b></p><p><b>　　1 前言</b></p><p>　　多酚氧化酶（EC.1.10.3.1）（polyphenol oxidase，PPO）是一種結(jié)構(gòu)復雜的多亞基含銅氧化還原酶，

17、屬六大類酶中的第一大類氧化還原酶[1]。它早在1895年就被發(fā)現(xiàn)，直至1937年才被分離得到。多酚氧化酶具有操作條件溫和，反應專一性好等優(yōu)點[2]。其特征是能夠通過分子氧氧化酚或多酚形成對應的醌[3]。在廣義上，多酚氧化酶可分為三大類：單酚單氧化酶（酪氨酸酶，tyrosinase，EC.1.14.18.1）、雙酚氧化酶（兒茶酚氧化酶，catechol oxidse，EC.1.10.3.2）和漆酶[4]（laccase，EC.1.10.3

18、.1）。在這三大類多酚氧化酶中，兒茶酚酶主要分布在植物中，微生物中的多酚氧化酶主要包括漆酶和酪氨酸酶?，F(xiàn)在大部分文獻所說的多酚氧化酶一般是兒茶酚氧化酶和漆酶的統(tǒng)稱。多酚氧化酶來源廣泛，在自然界中其分布極廣，普遍存在于植物、真菌、昆蟲的質(zhì)體中，甚至在土壤中腐爛的植物殘渣上都可以檢測到多酚氧化酶的活性[4]。多酚氧化酶由于其檢測方便，是被最早研究的幾類酶之一[5]。但是，也有研究表明，不同生物中的多酚氧化酶氨基酸數(shù)目差異很大，不同來源的多&

19、lt;/p><p>　　在高等植物中，多酚氧化酶是由核編碼的含銅的金屬蛋白酶，定位于質(zhì)體內(nèi)囊體，天然狀態(tài)無活性，但將組織勻漿或損傷后PPO被活化，從而表現(xiàn)出活性。當多酚氧化酶與底物接觸相互作用，氧化底物產(chǎn)生活性的醌，醌自聚發(fā)生合并和細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)氨基酸基團反應，產(chǎn)生黑色和褐色物質(zhì)，這也是組織中酶促褐變的主要原因[7]。因此，多酚氧化酶是生物體內(nèi)黑色素合成的關(guān)鍵酶，與人的衰老，昆蟲的傷口愈合與發(fā)育，果蔬的褐變有密切關(guān)系

20、[4,8]。然而山藥在加工和貯藏過程中很容易發(fā)生褐變，引起色澤、風味和質(zhì)地的變化，從而影響山藥的商業(yè)價值。酶促褐變是果蔬加工過程中普遍存在的現(xiàn)象，尤其是發(fā)生在肉質(zhì)顏色較淺的水果、蔬菜上。當果蔬受到機械損傷或處于不良環(huán)境，如受凍、受熱時，尤其在加工過程中，果蔬內(nèi)的多酚類物質(zhì)在多酚氧化酶的催化作用下氧化而呈現(xiàn)褐色。褐變影響果品的營養(yǎng)與外觀品質(zhì)，從而降低產(chǎn)品的商品品質(zhì)與市場售價。山藥PPO位于其正常細胞的質(zhì)體中，山藥受到損傷后，PPO釋放出來

21、。在有氧環(huán)境中，催化酚類物質(zhì)為鄰醌，然后鄰醌繼續(xù)相互作用生成高分子聚合物或與氨基酸或與蛋白質(zhì)生成高分子絡合物，導致褐色素的生成。目前生產(chǎn)上普遍采用熏硫法來抑制山藥褐</p><p>　　近年來，隨著生物技術(shù)日新月異的發(fā)展，酶工程在各個領(lǐng)域的應用起著越來越重要的作用[1]。多酚氧化酶的研究也一直受到國內(nèi)外的關(guān)注，其研究涉及生物、醫(yī)學、農(nóng)學、化學、藥學等多個學科和領(lǐng)域，具有多種生理功能，如采用酶工程技術(shù)應用于醫(yī)藥產(chǎn)品

22、的制備，污染物的檢測，精細化工產(chǎn)品的生產(chǎn)，免疫抗病性，降解木質(zhì)素，調(diào)控IAA、葉綠體的能量轉(zhuǎn)移等[2]。同時具有較高的經(jīng)濟價值，與食品工業(yè)、三廢處理、醫(yī)藥衛(wèi)生關(guān)系較為密切，如用多酚氧化酶增強植物和固定化酶制品檢測環(huán)境中多酚類物質(zhì)，處理工業(yè)“三廢”、化學農(nóng)藥降解產(chǎn)生的酚和芳胺等，具有較大的開發(fā)價值[9]。</p><p>　　目前，多酚氧化酶在生化、生物學性質(zhì)方面的研究已取得了較大進展，人們一直在研究多酚氧化酶活性

23、的抑制劑和激活劑，以多酚氧化酶作為研究對象尋找更好的美白劑。有研究表明，其抑制劑熊果甙和曲酸可被作為化妝品中的增白劑，為色素沉著、黑色素瘤以及白癜風等色素疾病的預防和治療尋找新的手段[10]?，F(xiàn)在多酚氧化酶的研究主要集中在酶的分離純化、催化機制、活性調(diào)控以及多酚氧化酶基因及其在生物體內(nèi)的生理作用等方面，雖然人們已經(jīng)從微生物、植物及多種動物中提取并純化了多酚氧化酶，但在結(jié)構(gòu)方面，其三維結(jié)構(gòu)仍未得到，同時不同生物體中提取的多酚氧化酶種類也不

24、同，同工酶的存在為多酚氧化酶的研究增加了難度[6]。因此，此項研究還需要人們不斷尋找不同來源的多酚氧化酶，并對其酶學性質(zhì)和功能進行研究。</p><p>　　本實驗針對山藥易褐變，難保存，主要是探索酶的基本性質(zhì)和為防止褐變進行基礎研究。對多酚氧化酶特性進一步加以認識研究，探討山藥中多酚氧化酶的活力、最適pH、最適溫度、多酚氧化酶的熱穩(wěn)定性以及不同抑制劑對多酚氧化酶活性的影響等，從而為進一步研制出新型藥物和化妝品等

25、提供理論依據(jù)。</p><p><b>　　2 材料與方法</b></p><p><b>　　2.1材料與試劑</b></p><p>　　山藥（市售）；牛血清白蛋白（BR）；丙酮、檸檬酸、磷酸氫二鈉、乙醇、抗壞血酸、（NH4）2SO4、磷酸、氯化鈉、L­半胱氨酸、鄰苯二酚，均為分析純化學試劑。</p&g

26、t;<p><b>　　2.2儀器</b></p><p>　　本研究所采用的主要儀器和設備如表1所示。</p><p>　　表1 主要儀器和設備</p><p>　　2.3山藥多酚氧化酶的提取</p><p>　　2.3.1丙酮粉的制備</p><p>　　稱取50g已去皮的新鮮

27、山藥，迅速用不銹鋼刀切片，然后加入200mL丙酮（-20℃預冷），用高速組織搗碎機攪拌，混勻后抽濾，取濾餅真空干燥后得丙酮粉，置（-20℃）下備用。</p><p>　　2.3.2山藥多酚氧化酶粗酶液的制備</p><p>　　稱取1g丙酮粉，加入50mL Mcllvaine緩沖液（0.2mol/L磷酸氫二鈉-0.1mol/L檸檬酸，pH5.6），用攪拌機高速攪拌15min，4000r/m

28、in離心20min，上清液即PPO粗酶液。</p><p>　　2.3.3硫酸銨分級沉淀</p><p>　　（1）取粗酶液6份，每份10mL分別緩慢加入固體硫酸銨粉末至終濃度為10%-60%，進行(NH4)2SO4沉淀1h，4℃，用6000rpm，4℃的低溫離心機離心10min。沉淀用10mL Mcllvaine緩沖液溶解。分別測上清液和沉淀溶解液酶活。</p><p

29、>　　（2）鹽析：將粗酶液用20%的硫酸銨溶液鹽析4℃靜置2h，6000rpm離心10min，4℃，去除沉淀，保留上清液。然后將上清液加入硫酸銨進行50%的硫酸銨溶液鹽析，4℃靜置2h，6000rpm離心10min，4℃，去除上清液，用pH5.6的Mcllvaine緩沖液將離心好的沉淀溶解掉（使用的溶解液要盡量少）。</p><p>　?。?）透析：將上一步溶解好的溶液裝入處理好的透析袋中，放入500mL的

30、燒杯上，裝入pH5.6的Mcllvaine緩沖液500mL，用磁力攪拌機攪拌，并放入4℃的層析柜中，每3小時換一下透析液，透析12h。即獲得多酚氧化酶提取液，收集并保存于-20℃下備用。</p><p>　　2.4山藥多酚氧化酶提取液蛋白含量測定</p><p>　　采用考馬斯亮藍法，以牛血清蛋白為標準，在595nm波長下測定酶提取液中蛋白質(zhì)的含量。</p><p>

31、;　　2.4.1考馬斯亮藍試劑的配置</p><p>　　考馬斯亮藍G-250 100mg溶于50mL 95%乙醇，加入100mL 85% H3PO4，用蒸餾水稀釋至1000mL，濾紙過濾。最終試劑中含10%（W/V）考馬斯亮藍G-250，4.7%（W/V）乙醇，8.5%（W/V）H3PO4。</p><p>　　2.4.2標準蛋白質(zhì)溶液</p><p>　　牛血清

32、血蛋白，根據(jù)其純度用0.15mol/L NaCl配制成100µg/mL蛋白原液。</p><p>　　2.4.3標準曲線制作</p><p>　　表2 標準蛋白吸光度測定</p><p>　　以A595nm為縱坐標，標準蛋白含量為橫坐標，在坐標軸上繪制標準曲線。</p><p>　　2.4.4 蛋白質(zhì)含量的測定</p>

33、<p>　　將酶提取液，依照以上表格操作，測出樣品的A595nm，然后利用標準曲線或回歸方程求出樣品蛋白質(zhì)含量。</p><p>　　2.5山藥多酚氧化酶活性測定</p><p>　　在光徑1cm的比色皿中，加入Mcllvaine緩沖液100µL，0.2 mol/L的鄰苯二酚900µL，PPO粗酶液20µL，混勻，在35℃下測定PPO的活性。溶液

34、快速混勻后于420nm處測其吸光度，60s內(nèi)記錄酶活度，以初始直線段的斜率（△OD/ t） 計算酶活力。相對酶活力單位（U）定義為：在測定條件下，每分鐘引起吸光度改變1所需的酶量。</p><p>　　2.6山藥多酚氧化酶酶學性質(zhì)測定</p><p>　　2.6.1 Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖測定動力學常數(shù)</p><p>　　配制0.03-0.2mo

35、l/L不同濃度的鄰苯二酚，作為底物，在pH5.6，35℃條件下，測定不同底物濃度下山藥PPO的活性。作1/v與1/[S]雙倒數(shù)圖，從所得曲線計算山藥多酚氧化酶的動力學常數(shù)：米氏常數(shù)Km和最大反應速率常數(shù)Vmax。</p><p>　　2.6.2 pH值對PPO活性的影響</p><p>　　配制pH值3~7.5的系列Mcllvaine緩沖液，按上述方法分別測定不同pH值的Mcllvaine

36、緩沖液與酶液及底物混勻后的吸光度，即在試管中加入已配好的不同pH值的Mcllvaine緩沖液100µL，0.2 mol/ L的鄰苯二酚900µL，PPO粗酶液20µL，在35℃下測定山藥PPO的活性。</p><p>　　2.6.3溫度對PPO活性的影響</p><p>　　試管中，以0.2mol/L的鄰苯二酚溶液1800µL為底物，加入pH5.6的

37、Mcllvaine 緩沖液200µL，在不同溫度（20~60℃的溫度條件）下保溫10min，取出1000µL置比色皿中，加入相同溫度下保溫10min的PPO粗酶液20µL，混勻后迅速測定PPO的酶活。</p><p>　　2.6.4 PPO的熱穩(wěn)定性測定</p><p>　　取120µL PPO酶液，在50、60、70、80、90、100 ℃下水浴6

38、0min 后取出、冷卻，在8000r/min下離心5 min，取上清，加入含900µL 0. 2 mol/L鄰苯二酚和100µL Mcllvaine緩沖液的底物體系，混勻后測定PPO的酶活，以未經(jīng)熱處理的酶液為對照。</p><p>　　2.7抑制劑對PPO活力的影響</p><p>　　取30µL PPO酶液和等體積不同濃度的30µL抑制劑（檸檬酸

39、、NaCl、抗壞血酸、L­半胱氨酸）混合，35℃水浴3h。取550µL 0.2mol/L鄰苯二酚溶液，與550µL同一抑制劑溶液混合，35℃水浴10min，取1000µL作為底物。取20µL含抑制劑的酶液，與底物混勻后迅速測定PPO的酶活。設立不含抑制劑的測活體系作為空白對照。計算剩余酶活力（%），以抑制劑濃度為橫坐標，剩余酶活力為縱坐標作圖。</p><p>&

40、lt;b>　　3 結(jié)果與討論</b></p><p>　　3.1硫酸銨鹽析結(jié)果</p><p>　　粗酶液用不同濃度硫酸銨鹽析后，分別測定上清液和沉淀的PPO酶活力，所得結(jié)果如表2所示。結(jié)果表明，10%-40%硫酸銨鹽析后上清液酶活較大，而50-60%硫酸銨鹽析后上清液酶活力剩余較少；10%-40%硫酸銨鹽析后沉淀酶活較小，而50-60%硫酸銨鹽析后所得的沉淀酶活較大。根

41、據(jù)該結(jié)果，我們選擇20%硫酸銨鹽析來去除粗酶液部分雜質(zhì)，采用50%硫酸銨鹽析來收集PPO沉淀。</p><p>　　表3 硫酸銨分級沉淀結(jié)果</p><p>　　3.2 PPO提取液蛋白含量及比活計算</p><p>　　以A595nm為縱坐標，標準蛋白含量為橫坐標，在坐標軸上繪制標準曲線。據(jù)此作標準曲線圖如下：</p><p>　　圖1

42、標準蛋白濃度曲線</p><p>　　可得直線方程為：A595nm=0.0073x+0.4645</p><p>　　酶提取液測得A595nm=1.222</p><p>　　由方程計算得x=103.8µg/mL</p><p>　　山藥提取液中蛋白含量為0.1038mg/mL，測定酶活力，求得山藥多酚氧化酶提取液的比活為213.3

43、U/mg</p><p>　　3.3 山藥PPO酶學性質(zhì)分析</p><p>　　3.3.1 Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖和動力學常數(shù)</p><p>　　表4 不同濃度底物下的酶活力</p><p>　　根據(jù)表3作雙倒數(shù)圖如下：</p><p>　　圖2 Lineweaver-Burk雙倒數(shù)圖</

44、p><p>　　可得直線方程為：y=0.0474x+2.5481，根據(jù)圖可求出最大反應速率Vmax=0.3924 U，米氏常數(shù)Km=53.76 mol/L。</p><p>　　3.3.2 pH值與PPO活性的關(guān)系</p><p>　　圖3 pH對PPO活力的影響</p><p>　　由圖3結(jié)果表明，山藥中多酚氧化酶活力隨pH值升高而增強，到pH

45、為5.6時山藥多酚氧化酶的酶活最高，繼續(xù)升高pH后使山藥PPO活力下降。這是因為PPO是一種含銅的蛋白質(zhì)，在pH較低時，輔基銅將以Cu2+的形式解離出來，從而使PPO失去活性；而在堿性條件下，輔基銅會解離生成不溶性氫氧化銅，從而使PPO的活性顯著降低。韓富根等在煙草葉片多酚氧化酶的提取及其特征研究中指出，pH值為6.0時，多酚氧化酶活性最高；在偏堿條件下，酶的活性下降快[11]。于新等研究表明，草菇多酚氧化酶表現(xiàn)最適活性的pH值6.0~

46、6.8[12]?？梢姡煌参颬PO活性最適pH值差異很大。因此在山藥加工過程中，調(diào)節(jié)pH值能有效抑制酶促褐變，pH值對PPO活性影響顯著。</p><p>　　3.3.3 溫度與PPO活性的關(guān)系</p><p>　　圖4 溫度對PPO活力的影響</p><p>　　由圖4結(jié)果表明，山藥中PPO活力隨溫度的升高而增強，35℃時活力最高，當溫度繼續(xù)上升時其活力開始下降

47、，在35-60℃范圍內(nèi)其下降趨勢平緩。由圖可以看出，山藥中多酚氧化酶活力最高時的溫度在35℃左右，溫度的變化影響了酶的活力，酶的活力隨溫度的下降到25℃后顯著降低。PPO的耐熱性都較差， 一般在70℃以上的高溫處理后，酶活性顯著降低。因此山藥加工過程中可采用熱燙鈍化PPO的活性，抑制褐變的發(fā)生。在山藥的貯藏過程中也要考慮溫度的影響，應低于25℃。Mespilus germanica L，Rosacea 也曾報道了歐楂果中多酚氧化酶在35

48、℃時其活力最大[13] 。</p><p>　　3.3.4 PPO 熱穩(wěn)定性</p><p>　　圖5 PPO的熱穩(wěn)定性曲線</p><p>　　圖5表明將酶液放置于50-100℃溫度下水浴處理1h，冷卻至35℃后進行酶活力測定。結(jié)果表明：雖然酶在50-60℃下活力較高，但經(jīng)較長時間（1h） 高溫處理后，酶就會失去部分活力。當溫度高于85℃，酶就徹底失活。這是因為不

49、適宜的溫度破壞了PPO活性部分三維結(jié)構(gòu)的完整性，從而影響其活性。 </p><p>　　3.4抑制劑對PPO 活性的影響</p><p>　　抑制劑對多酚氧化酶的作用機理是作用于產(chǎn)物的還原或抑制酶的活性。PPO的輔基為銅離子，從理論上說，有兩種類型的抑制劑：其一，與銅離子作用從而抑制酶活性的物質(zhì)；其二，影響底物與酶作用部位結(jié)合的物質(zhì)。抑制劑的研究對于山藥加工過程防止褐變具有重要的應用價值。

50、</p><p>　　3.4.1檸檬酸對PPO的抑制作用</p><p>　　圖6 檸檬酸對PPO活力的抑制作用</p><p>　　從圖6中可以看出，在檸檬酸濃度0~0.2（mol/L）內(nèi)，隨著檸檬酸濃度的不斷增大，山藥中多酚氧化酶的活力逐漸減小，多酚氧化酶活力受到了抑制。當檸檬酸濃度達到0.02mol/L后，再隨濃度的升高，山藥多酚氧化酶的活性下降趨勢趨于平緩。

51、而且在濃度超過0.07mol/L時，酶活性只有原來的24%。這表明提高檸檬酸的濃度能有效地抑制PPO的活性。原因是：酸性溶液既可以降低pH值，抑制對多酚氧化酶的活力，酸性溶液中氧氣溶解度較小而兼有抗氧化作用。檸檬酸中羰基可與多酚氧化酶的銅離子產(chǎn)生比較強的螯合作用，對山藥多酚氧化酶的活力有一定抑制[14]。</p><p>　　3.4.2 NaCl對PPO的抑制作用</p><p>　　圖7

52、 NaCl對PPO活力的抑制作用</p><p>　　從圖7中可以看出，NaCl的濃度在0~0.15（mol/L）內(nèi)，隨著NaCl的濃度不斷增大，山藥多酚氧化酶的活力不斷減小，多酚氧化酶活力受到了抑制。當NaC濃度達到0.15mol/L后，再隨濃度的升高，山藥多酚氧化酶的活性下降趨勢趨于平緩。而且在濃度超過0.2mol/L時，酶活性只有原來的28%。原因是：NaCl溶于水后，能減少水中的溶解氧，從而使酚類氧化酶難

53、與氧直接接觸，且鈉離子與多酚氧化酶中銅離子競爭，降低了多酚氧化酶的活力[15]。且食鹽溶液具有高的滲透壓，也可以使酶脫水失活。但過高濃度的NaCl溶液會影響懷山藥的口感，對人體也較為不利，不宜采用過高濃度的食鹽對山藥進行處理。</p><p>　　3.4.3 L­半胱氨酸對PPO的抑制作用</p><p>　　圖8 L­半胱氨酸對PPO活力的影響</p>

54、<p>　　從圖8中可以看出，隨著L­半胱氨酸濃度的不斷增大，山藥多酚氧化酶的活力不斷減小，多酚氧化酶活力受到了抑制，當其濃度超過200µmol/L時，其活力幾乎被徹底抑制，抑制效果較好。L­半胱氨酸對PPO活性的抑制作用是和酶促褐變反應的中間產(chǎn)物醌生成穩(wěn)定的無色物質(zhì)，抑制了次級氧化和聚合反應，阻止了黑色素的生成。由于L­半胱氨酸對醌有偶合作用，從而起到了抑制的作用[16]。對L

55、73;半胱氨酸的抑制機理至今仍然存在爭議：一種觀點認為，褐變被抑制主要是因為底物酚被氧化后生成醌，不與其他醌類、氨基酸和蛋白質(zhì)等聚合生成有色物質(zhì)，而是直接與L­半胱氨酸結(jié)合形成一種新的無色硫氫化合物；另一種觀點則認為，由于L­半胱氨酸中的­SH基團對Cu具有很強的親合力，可以去除PPO活性中心的銅或取代與活性中心的銅緊密配合的組氨酸殘基，通過對活性中心的結(jié)構(gòu)性修飾使酶活降低；也有研究者認為這兩種機制并存。針

56、對L­半胱氨酸對山藥多酚氧化酶的真正抑制機理還需進一步探討研究。</p><p>　　3.4.4 抗壞血酸對PPO的抑制作用</p><p>　　圖9 抗壞血酸對PPO活力的影響</p><p>　　從圖9中可以看出，在抗壞血酸濃度在0~20（µmol/L）內(nèi)，隨著抗壞血酸濃度的不斷增大，山藥多酚氧化酶的活力不斷減小，多酚氧化酶活力也受到了抑制。

57、然而在濃度在20~80（µmol/L）內(nèi)，隨著濃度的升高，山藥多酚氧化酶的活性下降速度趨于平緩。當其濃度超過100µmol/L時，其活力幾乎被徹底抑制?？箟难釋PO活性的抑制機理是將酶促反應的中間產(chǎn)物鄰二醌還原為鄰二酸和脫氫抗壞血酸，防止中間產(chǎn)物進一步聚合成黑色素而抑制褐變；抗壞血酸對褐變的抑制效果在很大程度上取決于它的濃度，只有反應體系中有較高濃度的抗壞血酸，才能不斷還原酶促反應生成的醌，直到酶失活為止?？箟难?/p>

58、酸為山藥的固有營養(yǎng)成分，安全性高，是理想的褐變抑制劑。</p><p>　　表5 四種抑制劑抑制效果的比較</p><p>　　不同濃度的檸檬酸、NaCl、抗壞血酸、均對山藥PPO活性的抑制有比較明顯的效果。由抑制結(jié)果可知：對山藥多酚氧化酶活性抑制效果的大小順序是L­半胱氨酸>抗壞血酸>檸檬酸>NaCl。其中L­半胱氨酸對山藥PPO活力抑制作用最好。

59、在實際生產(chǎn)中較為理想的抑制劑是抗壞血酸和L­半胱氨酸。它們既有較好的抑制效果，又是食品中固有的營養(yǎng)成分，且安全性高。</p><p><b>　　4 結(jié)論</b></p><p>　　根據(jù)酶反應初速與底物濃度的定量關(guān)系及米氏方程進行Km與Vmax的計算，得出反應的動力學方程：y=0.0474x+2.5481，R2=0.9733。在底物濃度0.03～0.2mo

60、l/L之間，pH值5.6，溫度35℃時，根據(jù)方程可求出最大反應速度Vmax=0.3924U，米氏常數(shù)Km=53.76mol/L。</p><p>　　在一定pH值條件下多酚氧化酶的活性受溫度影響也較大，溫度過低抑制了山藥中多酚氧化酶的活性，而溫度過高，容易導致多酚氧化酶失去活性，通過在一定pH值的不同溫度的條件下對多酚氧化酶活性研究發(fā)現(xiàn)，山藥多酚氧化酶的最適溫度是35℃。</p><p>

61、　　將該酶在50~100℃的溫度下水浴處理1h，酶活力均有所喪失，當溫度達到85℃時，徹底失活。在一定的溫度下的酸性環(huán)境中，山藥多酚氧化酶表現(xiàn)出的活力隨著pH增大不斷增大，當pH為5.6 時酶活力達到最大值，山藥多酚氧化酶活力的適宜pH偏酸性。這跟大多數(shù)陸生植物中多酚氧化酶活力的最適pH值在酸性區(qū)域相符合。</p><p>　　從以上各抑制劑對PPO活力的影響圖表中可以看出，供試的幾種抑制劑對PPO活力均有一定的

62、抑制作用，抗壞血酸濃度達到100µmol/L與L­半胱氨酸濃度達200µmol/L，山藥多酚氧化酶活性幾乎被徹底抑制。而NaCl濃度濃度達到0.2mol/L與檸檬酸濃度達到0.07mol/L以上，對山藥多酚氧化酶的抑制才更明顯。在反應體系中，抗壞血酸既可以作為醌類的還原劑又可以作為酶分子中銅離子的螯合劑，或起到競爭性的抑制作用，抗壞血酸不但能降低體系中的醌類及其衍生物還原成酚，并通過自身氧化來減少體系中的含

63、氧化量。另外，抗壞血酸對反應體系的影響，很大程度取決于抗壞血酸的濃度大小。L­半胱氨酸對山藥多酚氧化酶的效應為不可逆的抑制。我們認為L­半胱氨酸也可與山藥PPO酶蛋白不可逆地結(jié)合從而抑制其酶促反應。因此，L­半胱氨酸抑制山藥PPO的作用機理在于它既可作用于產(chǎn)物多巴醌生成穩(wěn)定的無色物質(zhì)又可通過與酶蛋白不可逆結(jié)合而作用于酶蛋白。然而檸檬酸的抑制效果比NaCl好，是因為檸檬酸在抑制酶促褐變方面具有雙重作用，不但可

64、以作為酸味劑降低體系中的pH值，使山藥多酚氧化酶遠離其最適作用范圍而降低酚酶的活性，另外，檸檬</p><p>　　以上研究表明抗壞血酸、檸檬酸、NaCl、L­半胱氨酸這些均是多酚氧化酶的抑制劑，天然的多酚氧化酶活性抑制劑可能是一種替代非天然多酚氧化酶活性抑制劑的先導化合物的良好來源。</p><p>　　總結(jié)：針對山藥易褐變，難保存，PPO是酶促褐變的主要因素，PPO活性高的山

65、藥品種易褐變。因此在山藥加工中，為避免褐變影響食品的外觀質(zhì)量及其內(nèi)含蛋白質(zhì)的營養(yǎng)價值，可通過向山藥中添加抗氧化劑（ 如抗壞血酸、L­半胱氨酸等）而有效地防止褐變的發(fā)生；或在生產(chǎn)、加工、儲藏和運輸?shù)冗^程中，都要盡量避開PPO的適宜溫度及pH值，從而盡可能減少褐變帶來的影響，以保證其營養(yǎng)價值。</p><p><b>　　參考文獻</b></p><p>　　[

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73、，從論文的選題、試驗的設計、資料收集、實驗開展到論文的完稿，斯老師均給予了詳盡的指導。導師淵博的知識、嚴謹?shù)闹螌W態(tài)度和精益求精的工作作風，求實創(chuàng)新及忘我的工作精神使我獲益匪淺，終生受益。在此，謹向?qū)熤乱宰钫\摯的敬意與最衷心的感謝！</p><p>　　同時感謝王老師在實驗期間給予的幫助，為實驗的順利進行提供了很大的支持與協(xié)助。在此致以衷心的感謝！感謝實驗室的每位成員！</p><p>