大斑剛毛座腔菌漆酶基因功能驗證及高產漆酶發(fā)酵條件優(yōu)化.pdf

1、漆酶作為一種多酚氧化酶，不僅在真菌的生活史中發(fā)揮著重要作用，同時在工業(yè)生產中具有一定的應用價值。本研究為了分析漆酶在玉米大斑剛毛座腔菌中的功能，利用實時熒光定量PCR技術分析了該病菌漆酶家族多個基因在發(fā)育階段和誘導條件下的表達規(guī)律;繼而利用原生質體轉化獲得了其中較為重要的StLAC1和StLAC2基因回復突變體，并分析了它們在在生長發(fā)育及侵染中的功能;此外利用響應面法優(yōu)化大斑剛毛座腔菌產漆酶的發(fā)酵工藝，研究結果為進一步開發(fā)應用奠定了基礎

2、。主要研究結果如下:
　　1.利用實時熒光定量PCR技術分析了大斑剛毛座腔菌漆酶多基因家族中的多個基因表達規(guī)律，結果顯示不同漆酶基因在病菌不同發(fā)育時期及不同誘導物下的轉錄表達量具有差異性，其中StLAC1主要在附著胞和侵入釘時期表達，說明其主要參與了侵染過程;StLAC2只有在分生孢子時期表達量明顯高于其他漆酶基因，說明StLAC2主要在分生孢子發(fā)育時2發(fā)揮作用;StLAC6、StLAC8除在分生孢子時期之外的其他時期表達水平均較

3、高;StLAC2、StLAC4、StLAC5在植保素白藜蘆醇的誘導下表達量明顯增加;StLAC6、StLAC8在ABTS及銅離子誘導下表達量增加。以上結果說明，漆酶家族各基因在侵染過程的不同時期及不同培養(yǎng)條件下分別發(fā)揮作用。
　　2.利用原生質體轉化技術，通過PEG介導轉化法獲得了突變菌株△StLAC1、△StLAC2基因的功能回復突變體C.△StLAC1、C.△StLAC2。
　　3.對大斑剛毛座腔菌野生型菌株01-23、

4、敲除突變體△StLAC1、回復突變體C.△StLAC1進行表型分析發(fā)現，相比于基因缺失突變體△StLAC1，回復突變體C.△StLAC1生長速率變快，黑色素合成增加，滲透調節(jié)能力減弱，附著胞膨壓、侵染能力顯著回復，漆酶活性增強，離體葉片致病性變強。說明StLAC1基因在大斑剛毛座腔菌黑色素合成、附著胞穿透力和致病性等方面具有重要作用。
　　4.對大斑剛毛座腔菌野生型菌株01-23、敲除突變體△StLAC2、回復突變體C.△StLA

5、C2進行表型分析發(fā)現，回復突變體C.△StLA C2氣生菌絲茂盛，菌絲細胞壁變厚，疏水能力變強，耐鹽性降低，細胞壁完整性回復;漆酶活性有所升高，黑色素合成能力回復，侵染能力顯著上升。說明StLAC2基因影響了大斑剛毛座腔菌黑色素合成、附著胞穿透力和生長發(fā)育等諸多方面。
　　5.以質粒pBS為骨架，以草銨膦的基因為抗性基因，成功構建了StLAC2基因的敲除載體，通過原生質體轉化法獲得StLAC1、StLAC2雙基因缺失突變體△StL

6、AC2/△StLAC2。
　　6.建立了以漆酶酶活力為響應值的多元二次回歸模型，多元二次回歸模型差異顯著(p=0.0001)，可以用該模型來擬合試驗;響應面分析結果表明，各因素對漆酶活性的影響大小依次為Cu2+＞葡萄糖＞尿素，而葡萄糖和尿素交互作用極顯著;通過擬合求出模型極值點，對應的大斑剛毛座腔菌產漆酶的最佳培養(yǎng)條件為:葡萄糖50.05g/L，KH2PO41g/L，尿素1.46 g/L，MgSO40.5 g/L，蛋白胨2g/L，