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文檔簡介
1、枯草芽孢桿菌合成的脂肽是以β-羥基脂肪酸和肽通過內(nèi)酯鍵結(jié)合,以脂肪酸鏈作為疏水基團,氨基酸鏈或者環(huán)作為親水基團的一類生物表面活性劑。其表面活性強、低毒、易于降解,在生物采油、醫(yī)藥、材料、環(huán)保、食品和日化等行業(yè)具有廣闊的應(yīng)用前景,已成為研究的熱點之一。本文主要從脂肽高產(chǎn)菌株的常壓室溫等離子體(ARTP)誘變選育、搖瓶發(fā)酵條件優(yōu)化、脂肽的性質(zhì)及鑒定等方面進(jìn)行了研究。
本研究主要內(nèi)容包括:⑴對出發(fā)菌株進(jìn)行搖瓶發(fā)酵條件優(yōu)化。通過單因素
2、實驗初步得到搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L):蔗糖30、尿素4、酵母膏1、磷酸二氫鉀10、磷酸氫二鈉4、氯化鈉5、硫酸鎂0.3、谷氨酸鈉1.2、pH8.2。采用斜面種接種,200rpm,37℃培養(yǎng)72h,排油圈直徑由3.6提高到6.5(cm),脂肽產(chǎn)率由0.45提高到3.21(g/L)。⑵采用ARTP技術(shù)對脂肽合成菌株進(jìn)行誘變選育,高產(chǎn)菌株菌落飽滿偏大,中間凸起,泡高、微發(fā)白,邊緣褶皺,菌苔存在較多的粘性物質(zhì),挑取拉絲。經(jīng)多次誘變選育,獲得一株
3、遺傳穩(wěn)定的脂肽高產(chǎn)菌株,命名為Bacillus subtilis SF90。相比初始菌株,搖瓶發(fā)酵周期縮短到60h,脂肽生物表面活性提高約2.3倍,產(chǎn)率由1.93提高到5.12(g/L)。⑶金屬元素Zn2+、Fe2+、Mn2+、Cu2+單因素實驗表明:極微量的金屬離子對脂肽的合成均具有顯著促進(jìn)作用;正交實驗結(jié)果表明,在培養(yǎng)基中添加ZnSO4·7H2O1.0mg/L,F(xiàn)eSO4·7H2O0.2mg/L,MnSO4·H2O0.5mg/L,表
4、面活性提高約3倍,脂肽產(chǎn)率由6.11提高到11.12(g/L)。⑷在發(fā)酵前期(0-12)h以及發(fā)酵后期(44-48)h添加0.001-0.01(g/L)的氨基糖苷類抗生素(奇霉素、慶大霉素、卡拉霉素)能夠明顯促進(jìn)脂肽的合成,微量的奇霉素可造成發(fā)酵后期菌體形態(tài)拉長,利于脂肽胞外分泌降低胞內(nèi)的反饋抑制,并使脂肽表面活性提高約2.2倍,產(chǎn)率由3.3提高到6.02(g/L)。⑸采用Bacillus subtilis SF90的發(fā)酵上清液,研究脂
5、肽對溫度和pH的耐受性,及其乳化性、絮凝性和抑菌性等性質(zhì)。在121℃滅菌2h,脂肽生物表面活性損失率約為10%;在4℃冰箱貯存3月,生物表面活性幾乎不變;pH耐受范圍為2-12,當(dāng)溶液呈弱酸及弱堿性時,生物活性則更好;相比洗潔精,脂肽發(fā)酵液對原油具有更穩(wěn)定持久的乳化效果;相比明礬與聚谷氨酸,脂肽同樣具有良好的絮凝性;對蠟樣桿菌Bacillus cereus、綠膿桿菌Pseudomonas aeruginosa、玉米黑霉Ustilagom
6、aydis corola抑菌效果非常顯著,最低抑菌質(zhì)量濃度MIC分別為0.1mg/ml、0.25mg/ml、0.15mg/ml,對水稻紋枯菌、小麥全噬菌也有較好的抑制性作用。⑹用MALDI-TOF-MS技術(shù)對脂肽凍干樣品進(jìn)行組份鑒定,結(jié)果表明Bacillus subtilis SF90產(chǎn)生的脂肽由Surfactin、BacillomycinD、Fengycin組成。其中,Surfactin為主要物質(zhì),出峰時間為21.5-25(min),
7、質(zhì)荷比(m/z)主要包括1008.6615、1022.6710、1036.6893、1058.6682、1044.6682、1030.6370、1059.6711等;其次為Bacillomycin D,出峰時間為9.7-12(min),質(zhì)荷比(m/z)為1031.5400、1045.5541、1059.5696;Fengycin的量較少,出峰時間為12.5-14.5(min),質(zhì)荷比(m/z)主要包括1464.8008、1477.813
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