纖維素降解細菌新種的酶學特性及基因組文庫構(gòu)建策略.pdf

1、當前，隨著全球人口的增長及對不可再生資源的大量消耗，資源利用危機已經(jīng)顯露端倪。纖維素物質(zhì)作為自然界中最為豐富的有機物質(zhì)及可再生資源，因其具有充足的供應(yīng)及低廉的價格，所以對其進行大規(guī)模的轉(zhuǎn)化利用有著非常誘人的前景。然而，由于其具有高結(jié)晶的抗性構(gòu)造，所以要把它水解成可利用的小分子單糖相當困難，因此直到目前為止纖維素物質(zhì)仍沒有得到非常廣泛的轉(zhuǎn)化利用。所以，當前針對纖維素物質(zhì)資源的轉(zhuǎn)化利用研究，已經(jīng)在全世界范圍內(nèi)引起了高度的重視。
　　本

2、文針對纖維素物質(zhì)利用過程中所關(guān)注的熱點問題，以纖維素降解細菌為研究對象，分別從纖維素降解微生物資源的開發(fā)、纖維素酶學特性分析以及菌株的基因組文庫構(gòu)建等角度進行了研究和論述。首先，利用梯度稀釋法及平板畫線純化法分離到一株具有表達纖維素酶能力的細菌菌株，基于1440bp的16SrDNA序列比對分析后發(fā)現(xiàn)，分離菌株與Vibrioscophthalmi的親源關(guān)系較為接近，其序列同源率為97.92％，表明菌株應(yīng)為纖維弧菌屬內(nèi)的一個成員。在16S-

3、23SrDNA間隔區(qū)（ISRs）序列中存在保守的tRNAala和tRNAile基因編碼區(qū)，而在可變區(qū)中不具有同源序列，基因組中的G+Cmol％含量為53.07mol%，略高于弧菌屬內(nèi)的其它典型菌株。另外，菌株與其它高同源性及相近生理特性細菌之間在生理特性上也存在一些明顯的差異。多項分類鑒定結(jié)果表明，所分離菌株在系統(tǒng)進化發(fā)育上應(yīng)該是有別于弧菌屬內(nèi)其它典型細菌的一個新類型菌株。
　　菌株所表達的纖維素酶系統(tǒng)為誘導酶，其中包括CMCas

4、e、EG及BGL三種酶蛋白成分，其酶蛋白量在酶系中的比例接近3.1:1.4:1.0。纖維素酶系統(tǒng)發(fā)揮活性的最適pH為5.0至5.5，最適溫度為50℃。Zn2+、Fe2+及Ca2+對于纖維素酶系統(tǒng)的活性有明顯的促進作用，而Fe3+與Hg2+對于酶系統(tǒng)活性有非常強烈的抑制作用。菌株采用了不同的代謝機制完成對纖維素物質(zhì)和可溶性糖的代謝。菌株以濾紙纖維素作為碳源的發(fā)酵過程中，體系中的還原糖量在初始階段積累增加，但是隨著代謝的進行還原糖量開始迅速

5、降低，反應(yīng)結(jié)束后體系中的還原糖量變得極其微少。酶系統(tǒng)中的羧甲基纖維素酶和濾紙纖維素酶組分主要定位在細胞外膜。
　　此外，分別采用四堿基位點識別限制酶Sau3AI和六堿基位點識別限制酶PstI作為工具酶，構(gòu)建了菌株的Sau3AI和PstI雙基因組文庫。菌株高濃度基因組樣品的制備、重組體構(gòu)建過程中DNA片段的最佳連接比例及宿主菌株對重組體所具有的高感受能力為基因組文庫的完整性構(gòu)建奠定了堅實的基礎(chǔ)。對雙文庫中隨機挑取克隆子中的重組質(zhì)粒進