家蠶小熱休克蛋白22.6的克隆表達(dá)與功能初步研究

1、浙江理工大學(xué)碩士學(xué)位論文家蠶小熱休克蛋白22.6的克隆表達(dá)與功能初步研究姓名：鄭碧申請學(xué)位級別：碩士專業(yè)：生物化學(xué)與分子生物學(xué)指導(dǎo)教師：張耀洲20091201A b s t r a c tS m a l l h e a t s h o c k p r o t e i n s ( s H S P ) a r e ac l a s s o ff u n c t i o n a l l y r e l a t e d p r o t e i

2、n s w h o s ee x p r e s s i o ni s i n c r e a s e dw h e n c e l l s a r ee x p o s e dt o e l e v a t e dt e m p e r a t u r e so r o t h e rs t r e s s ．A s am o l e c u l a rc h a p e r o n e ，s H S P sh a v eb e e

3、ns h o w nt o b e a s s o c i a t e d 謝廿la n u m b e ro fb i o l o g i c a lp r o c e s s e s i n c l u d i n g c e l lp r o l i f e r a t i o na n d d i f f e r e n t i a t i o n ．W e o b t a i n e d a s e q u e n c ef

4、r o m t h ee D N A l i b r a r yc o n s t r u c t e db y o u r l a b o r a t o r y ，w h i c h h a s a l lO R F o f5 9 7b pc o d i n g19 8a m i n oa c i dr e s i d u e so ft h ea n a l y s i so fh o m o l o g y ．T h ep r

5、o t e i ni s al l i 曲l y c o n s e r v a t i v e s i l k w o r ms m a l lh e a t s h o c kp r o t e i n2 2 ．6 ( B m H S P 2 2 ．6 ) w i t h a c o n s e r v e da —c r y s t a l l i nd o m a i n ．I no r d e rt oo b t a i nt

6、 h ep o l y c l o n a la n t i b o d i e so fB m H S P 2 2 ．6 ，t h e O R F w a si n s e r t e di n t o t h ep E T - 2 8 av e c t o ra n d c o n s t r u c t e dt h er e c o m b i n a n tp E T - 2 8 a - B m H S P 2 2 ．6 ．1

7、 1 1 ef u s i o np r o t e i nw a s e x p r e s s e ds u c c e s s f u l l yi n E ．c o l iB L 2 1S t a r ( D E 3 ) b y a d d i n gI P T G ( 1 m M ) f o ri n d u c t i o n ，a n di t W a ss o l u b l e ．T h es o l u b l eH

8、 i s —t a g B m H S P 2 2 ．6p r o t e i nw a sp u r i f i e dv i an i c k e la f f i n i t y c o l u m n c h r o m a t o g r a p h y a n d u s e d t o i m m u n i z e a m a l eN e wZ e a l a n d r a b b i t ．T h ep o l y

9、 c l o n a la n t i b o d yw h o s et i t e rW a s l a r g e rt h a n1 ：6 4 0 0W a s o b t a i n e d ，a n di t s s p e c i f i cr e a c t i o nw a s w e l l d e t e c t e d i n W e s t e r n b l o t a n a l y s i s ．I t

10、w a s a l s o c o m p a r e d t h a t t h e q u a n t i t y o fB m H S P 2 2 ．6i n d i f f e r e n tt i s s u e so f t h ef i f t h i n s t a rl a r v aa n dd i f f e r e n t s t a g e so fs i l k w o r m ．T h er e s u l

11、 ts h o w e d t h a tB m H S P 2 2 ．6e x i s t e di na d u l ta n d a l o to f t i s s u e si nw h i c h e p i d e r m i sa n dh e a dw e r eh i g h e r ．B m H S P 2 2 ．6e x p r e s s i o n w a s s i g n i f i c a n t l

12、yi n c r e a s e db y h e a ts h o c kt h es p i n n i n gl a r v aa n d p u p ad e t e c t e db yE L I S A a n dW e s t e r n b l o ta n a l y s i s ．A n t i - B m H S P 2 2 ．6a n t i b o d yW a s u s e d t oe x a m i n

13、 e t h e e f f e c to f h e a ts t r e s so n l o c a l i z a t i o no f B m H S P 2 2 ．6i ni n d i r e c ti m m u n o f l u o r e s c e n c ea s s a y s ．B m H S P 2 2 ．6 w a s f o u n d i n c y t o p l a s m ，a f t e r

14、 h e a t t r e a t e d ，t h e e x p r e s s i o n l e v e l o fB m H S P 2 2 ．6b e c a m e h i g h e r ．T h e s er e s u l t sp r o v i d e da b e R e ru n d e r s t a n d i n go f c e l l u l a rp r o t e c t i o nm e c

15、 h a n i s m sa g a i n s te n v i r o n m e n t a ls t r e s ss u c ha sh e a ts h o c k ．F i n a l l y , i tW a s s t r o n g l yi n d i c a t e dt h a t B m H S P 2 2 ．6 W a so fc h a p e r o n e ·l i k e a c t i

16、 v i t y i n t h a t t h e B m H S P 2 2 ．6 p r o t e i n e f f e c t e da g g r e g a t i o no f l y s o z y m e o n c o n c e n t r a t i o nb a s e ．K e y w o r d s B m H S P 2 2 ．6 ：p r o k a r y o t i c e x p r e s