氧化-內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激信號(hào)途徑在弓形蟲感染致胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡中的作用研究.pdf

1、背景：剛地弓形蟲能夠感染幾乎所有溫血?jiǎng)游?其中包括全球約30％的人口。感染通常為無癥狀的隱形感染,但是孕期弓形蟲感染可能導(dǎo)致流產(chǎn),死產(chǎn),以及嚴(yán)重的智力發(fā)育低下,視網(wǎng)膜或神經(jīng)損傷。雖然弓形蟲感染引起的出生缺陷可能機(jī)制包括結(jié)構(gòu)性損傷,內(nèi)分泌失調(diào),胎盤組織細(xì)胞凋亡增加等幾個(gè)方面,但目前先天性弓形蟲病的關(guān)鍵發(fā)病環(huán)節(jié)和確切機(jī)制仍不清楚。弓形蟲在宿主細(xì)胞可引起雙重的凋亡效應(yīng)?，F(xiàn)前的一些研究表明,弓形蟲感染的細(xì)胞對(duì)凋亡刺激信號(hào)表現(xiàn)出相對(duì)的抵抗性;另一

2、方面,已經(jīng)發(fā)現(xiàn)弓形蟲急性感染可誘發(fā)CD4+小鼠脾細(xì)胞凋亡。研究已經(jīng)證明,高水平的細(xì)胞凋亡、高的死亡率與高毒力弓形蟲株感染相關(guān);相比之下,在慢性弓形蟲腦炎,只觀察到有少數(shù)細(xì)胞凋亡。因此,細(xì)胞凋亡的啟動(dòng)和凋亡的發(fā)展程度可能在弓形蟲病的發(fā)病機(jī)制和最終轉(zhuǎn)歸中起著關(guān)鍵作用?？傊?先天性弓形蟲病發(fā)病中的重要事件和確切機(jī)制仍不清楚。
　　內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)是細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)合成,折疊和組裝的主要細(xì)胞器。未折疊或錯(cuò)誤折疊蛋白的積累可導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)適應(yīng)性反應(yīng),

3、稱為未折疊蛋白反應(yīng)(UPR),最終導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激(ERS)。越來越多的證據(jù)顯示,在各種毒性物質(zhì),包括活性氧(ROS),化學(xué)物質(zhì)和重金屬引起細(xì)胞凋亡的調(diào)控中,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激起著關(guān)鍵的作用。氧化應(yīng)激是由于ROS生成和抗氧化能力之間的不平衡,這種應(yīng)激反應(yīng)通過多種信號(hào)通路引發(fā)細(xì)胞凋亡,如內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)和ASK1/JNK的活化。在一些疾病,如糖尿病,鎘中毒和神經(jīng)退行性疾病中,這些病理過程中可同時(shí)存在。此外,有越來越多的證據(jù)表明,氧化應(yīng)激在感染誘導(dǎo)的細(xì)

4、胞凋亡中起著重要的作用。
　　通常,由于母胎新陳代謝的需要,胎盤線粒體活動(dòng)和ROS的產(chǎn)生增加,孕期處于輕度氧化應(yīng)激狀態(tài)。在孕早期,由于絨毛間隙血流的建立,會(huì)在短時(shí)間誘發(fā)氧化應(yīng)激;胎盤先承受缺氧,然后缺氧/復(fù)氧的過程,機(jī)體如果不具備有效的抗氧化防御的能力將可能導(dǎo)致早期流產(chǎn)。妊娠后期,在妊娠并發(fā)糖尿病,胎兒宮內(nèi)生長(zhǎng)受限和先兆子癇中可發(fā)現(xiàn)滋養(yǎng)層細(xì)胞凋亡水平增加,氧化應(yīng)激水平增加。以往的研究發(fā)現(xiàn),在獻(xiàn)血員中,弓形蟲感染可導(dǎo)致氧化應(yīng)激和機(jī)體

5、的免疫抑制。正常母胎界面存在Th2免疫偏移現(xiàn)象,這不利于病原體的消除,增加了弓形體病的易感性。因此,弓形蟲孕期感染或隱性感染的激活會(huì)增加胎盤中的氧化應(yīng)激,促進(jìn)細(xì)胞凋亡和胎盤損傷,并最終導(dǎo)致比正常生理狀態(tài)更嚴(yán)重的結(jié)果。研究顯示在妊娠相關(guān)疾病中,氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡之間存在關(guān)聯(lián)。以往的研究表明,LPS可在多個(gè)組織中誘導(dǎo)氧化應(yīng)激,導(dǎo)致小鼠早產(chǎn)。一些研究發(fā)現(xiàn),滋養(yǎng)細(xì)胞可被弓形蟲強(qiáng)毒株感染,未感染的細(xì)胞會(huì)發(fā)生凋亡,而不是受感染的細(xì)胞;這個(gè)現(xiàn)象揭示弓

6、形蟲誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡并不是由于其在母胎界面的直接作用。
　　目的：探討體內(nèi)外剛地弓形蟲感染對(duì)滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡水平的影響;闡明先天性弓形蟲病和弓形蟲誘發(fā)細(xì)胞凋亡的具體機(jī)制和關(guān)鍵環(huán)節(jié);觀察抗氧化劑對(duì)弓形蟲誘發(fā)細(xì)胞凋亡的負(fù)向調(diào)節(jié)作用,對(duì)胎盤病理損傷的保護(hù)作用和作為處理相關(guān)疾病的潛在治療價(jià)值。
　　方法：(1)本實(shí)驗(yàn)首先使用ICR孕鼠建立孕期弓形蟲急性感染的小鼠模型。孕鼠被隨機(jī)分入感染組,抗氧化劑保護(hù)組和對(duì)照組中。在孕8天和孕9天,抗氧化

7、保護(hù)組孕鼠按照100mg/kg的計(jì)量被注射NAC。另外,在孕8天,感染組和抗氧化保護(hù)組的每只孕鼠經(jīng)腹腔注射200個(gè)速殖子。孕鼠處死后,小心剝離并取出胎盤,稱重,按照實(shí)驗(yàn)程序,制作細(xì)胞懸液或包氏液固定用于組織化學(xué)分析,另外,取部分胎盤液氮凍存。提取感染組孕12天小鼠胎盤RNA,采用包含84個(gè)氧化應(yīng)激關(guān)鍵基因芯片對(duì)胎盤組織的表達(dá)譜進(jìn)行分析。制作胎盤組織勻漿,按照檢測(cè)試劑盒操作說明,對(duì)MDA,GSH和8-OHdG進(jìn)行檢測(cè)。采用實(shí)時(shí)定量PCR方

8、法,對(duì)組織和血液標(biāo)本的弓形蟲含量,以及氧化應(yīng)激相關(guān)分子的表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。(2)分離胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞,通過抗角蛋白-7和波形蛋白抗體對(duì)其性質(zhì)進(jìn)行鑒定。體外感染使用,采用Transwell系統(tǒng)。在12孔培養(yǎng)板中,速殖子和胎盤細(xì)胞按照1×106:1×106比例加入上層;分離的胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞1×106,加入下層,37℃培養(yǎng),按照預(yù)定的時(shí)間收集細(xì)胞。胎盤組織制作的細(xì)胞懸液和原代培養(yǎng)的滋養(yǎng)細(xì)胞分別收集,通過流式細(xì)胞和原位末端標(biāo)記技術(shù)進(jìn)行細(xì)胞凋亡分析。采

9、用熒光定量PCR技術(shù)對(duì)胎盤組織氧化和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)標(biāo)記物進(jìn)行mRNA水平進(jìn)行檢測(cè)。(3)胎盤組織按照說明勻漿,培養(yǎng)的原代細(xì)胞直接加入100μl裂解緩沖液。裂解物經(jīng)SDS-PAGE電泳,蛋白印記分析GRP78,磷酸化JNK,p38,磷酸化p38,caspase-12和磷酸化ASK1進(jìn)行檢測(cè)。為了觀察NAC對(duì)胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞凋亡信號(hào)和前凋亡通路激活的影響,抗氧化保護(hù)組的胎盤組織和培養(yǎng)原代細(xì)胞被相應(yīng)處理,同時(shí)進(jìn)行熒光定量PCR,流式細(xì)胞和蛋白印記

10、分析。
　　結(jié)果：(1)成功建立弓形蟲孕期急性感染小鼠模型。在孕8天腹腔注射200個(gè)RH速殖子,感染小鼠在孕14后開始出現(xiàn)感染癥狀,但是多數(shù)在孕16天仍然存活。(2)通過PCR芯片分析,和正常對(duì)照組相比,感染組胎盤中有27個(gè)氧化應(yīng)激相關(guān)基因上調(diào)兩倍以上,9個(gè)基因下調(diào)兩倍以上。NADPH氧化酶1和谷胱甘肽過氧化酶6上調(diào)最為明顯,約升高25倍。抗氧化組中上述基因差不多回復(fù)到正常對(duì)照組的水平。通過定量PCR分析,感染組孕10天和孕12天

11、胎盤沒有發(fā)現(xiàn)弓形蟲感染,但是在14天出現(xiàn)感染的高峰。另外,研究顯示感染組在孕12天前可觀察到蟲血癥的出現(xiàn)和GSH水平的下降。GSH水平從正常組的9.29±2.26μM/gprot下降到感染組的4.18±1.54μM/gprot(p<0.01)。嚴(yán)重的氧化應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致脂質(zhì)和DNA的過氧化,表現(xiàn)為MDA和8-OHdG水平增高;分別從對(duì)照組的0.41±0.16μM/gprot和1.77±0.65μg/gprot升高到感染組的0.52±0.23

12、μM/gprot和3.88±0.89μg/gprot(p<0.05).NAC使用有效的減弱了過氧化損傷,特別是在早期階段?？寡趸Ｗo(hù)組中GSH,MDA和8-OHdG分別為9.42±2.40μM/gprot,0.45±0.21μM/gprot和3.42±1.63μg/gprot(p<0.01,0.05and0.05)。(3)原代培養(yǎng)的滋養(yǎng)細(xì)胞成無規(guī)律的多邊形生長(zhǎng),多數(shù)細(xì)胞(90.5±3.5%)為角蛋白-7陽性,通過流式細(xì)胞分析,另外大約有

13、5.1%細(xì)胞為巨噬細(xì)胞。另外,用抗波形蛋白抗體檢測(cè)為陰性,表明培養(yǎng)細(xì)胞中沒有成纖維細(xì)胞存在。弓形蟲感染導(dǎo)致胎盤滋養(yǎng)細(xì)胞的凋亡水平明顯增加,總凋亡率,早期凋亡率和晚期凋亡率分別從正常對(duì)照組的11.04±0.91%,9.77±0.99%和1.27±0.43%上升到60.71±16.96%,38.57±14.66%和22.14±3.20%。和感染組相比,用NAC預(yù)處理可以明顯降低凋亡水平,總凋亡率為40.28±8.96%,(p<0.05),晚

14、期凋亡下降更為明顯,為4.71±2.81%(p<0.05)。上述結(jié)論,被胎盤原位凋亡檢測(cè)進(jìn)一步證實(shí)。(4)通過熒光定量PCR和蛋白免疫印跡分析,我們發(fā)現(xiàn)感染組中,內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)記物,如GRP78,CHOP和caspase-12,JNK/ASK1信號(hào)上調(diào)或激活;NAC預(yù)處理可抑制上述基因的表達(dá)或信號(hào)通路的激活。本研究中,沒有發(fā)現(xiàn)p38的上調(diào)或活化。
　　結(jié)論：(1)通過在孕8天經(jīng)腹腔注射200個(gè)RH速殖子的方法,成功建立了孕期弓形蟲急