實驗一蛋白質(zhì)的等電點測定和沉淀反應(yīng)

1、一、實驗?zāi)康?1、了解蛋白質(zhì)的兩性解離性質(zhì)2、學(xué)習(xí)測定蛋白質(zhì)等電點的一種方法3、加深對蛋白質(zhì)膠體溶液穩(wěn)定因素的認(rèn)識4、了解沉淀蛋白質(zhì)的幾種方法及其實用意義5、了解蛋白質(zhì)變性與沉淀的關(guān)系,二、實驗原理,蛋白質(zhì)是兩性電解質(zhì)。在蛋白質(zhì)溶液中存在下列平衡：蛋白質(zhì)分子的解離狀態(tài)和解離程度受溶液的酸堿度影響。,當(dāng)溶液的pH為一定值時，蛋白質(zhì)極性基團(tuán)解離的正負(fù)離子數(shù)相等，凈電荷為0，此溶液的pH值為該蛋白質(zhì)的等電點。不同蛋白質(zhì)具

2、有各自特定的等電點，與該蛋白質(zhì)的組成結(jié)構(gòu)有關(guān)。在等電點時，蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)都有變化，可利用性質(zhì)的變化測定各種蛋白質(zhì)的等電點。常用方法：測其溶解度最低時的溶液pH值。,問題：蛋白質(zhì)等電點的測定還有哪些方法?,本實驗通過觀察不同pH溶液中酪蛋白的溶解度來測定其等電點。用醋酸與醋酸鈉（醋酸鈉混合在酪蛋白溶液中）配制各種不同pH值的緩沖液。向各緩沖溶液中加入酪蛋白后，沉淀出現(xiàn)最多的緩沖液的pH值即為酪蛋白的等電點。,在水溶液中，蛋白質(zhì)

3、分子由于表面生成水化層和雙電層而成為穩(wěn)定的親水膠體。在一定的理化因素影響下，蛋白質(zhì)顆粒可因失去電荷和脫水而沉淀。蛋白質(zhì)的沉淀反應(yīng)可分為兩類。,可逆的沉淀反應(yīng) 蛋白質(zhì)分子的結(jié)構(gòu)尚未發(fā)生顯著變化，除去引起沉淀的因素后，蛋白質(zhì)的沉淀仍能溶解于原來的溶劑中，并保持其天然性質(zhì)而不變性。如：鹽析作用、低溫下用乙醇（丙酮）短時間作用于蛋白質(zhì)。提純蛋白質(zhì)時，常利用此類反應(yīng)。,問題：提純蛋白質(zhì)時常用的沉淀方法有哪些?,不可逆沉淀反應(yīng),

4、蛋白質(zhì)分子內(nèi)部結(jié)構(gòu)發(fā)生重大改變，蛋白質(zhì)常變性而沉淀，不再溶于原來溶劑中。加熱引起的蛋白質(zhì)沉淀與凝固，蛋白質(zhì)與重金屬離子或某些有機(jī)酸的反應(yīng)都屬于此類。,問題：這些不可逆的沉淀反應(yīng)有哪些應(yīng)用?,蛋白質(zhì)變性后，有時由于維持溶液穩(wěn)定的條件仍然存在（如電荷），并不析出。因此變性蛋白質(zhì)并不一定都表現(xiàn)為沉淀，而沉淀的蛋白質(zhì)也未必都已變性。,三、試劑器材,1、實驗材料 雞蛋清 牛奶,2、儀器設(shè)備 水浴鍋 溫度

5、計錐形瓶 100mL容量瓶吸管試管及試管架,0.4% 酪蛋白乙酸鈉溶液：取20mL牛奶，加入10mL 1mol/L NaAC,用去離子水定容至100mL 1.00 mol/L 醋酸溶液 0.10 mol/L 醋酸溶液 0.01 mol/L 醋酸溶液,3、試劑,蛋白質(zhì)溶液：5%卵清蛋白溶液或雞蛋清的水溶液（新鮮雞蛋清:水=1:9）0.2M 醋酸-醋酸鈉緩沖液，pH4.7 3%硝酸銀溶液5%三氯乙酸溶液95%乙

6、醇飽和硫酸銨溶液：25℃，100mL水＋76.7g硫酸銨0.1 M鹽酸溶液0.1 M氫氧化鈉溶液0.05 M碳酸鈉溶液0.1 M醋酸溶液甲基紅溶液：pH變色范圍為4.4-6.2，由紅變黃,,,,四、實驗操作,（一）酪蛋白等電點的測定,（1）取4支試管，按下表順序分別加入各試劑，混勻。,（2）向以上試管中各加酪蛋白的醋酸鈉溶液1mL，加一管，搖勻一管。此時1、2、3、4管的pH依次為5.9、5.5、4.7、3.5。觀察其混濁度

7、。靜置10分鐘后，再觀察其混濁度。最混濁（有顆粒沉淀）的一管pH即為酪蛋白的等電點。,（二）蛋白質(zhì)沉淀實驗,1. 蛋白質(zhì)的鹽析,加5%卵清蛋白溶液5 mL于試管中，再加等量飽和硫酸銨溶液，混勻后靜置數(shù)分鐘則析出球蛋白的沉淀。離心，取沉淀，加少量水，觀察是否溶解。離心后上清液中添加硫酸銨粉末到不再溶解為止，此時析出的沉淀為清蛋白。離心，取出部分清蛋白，加少量蒸餾水，觀察沉淀能否重新溶解。,2. 重金屬離子沉淀蛋白質(zhì)取1支試管，加入

8、蛋白質(zhì)溶液2 mL，再加3%硝酸銀溶液1~2滴，振蕩試管，有沉淀產(chǎn)生。離心傾去上清液，向沉淀中加入少量的水，沉淀是否溶解？為什么？,3．有機(jī)酸沉淀蛋白質(zhì)取1支試管，加入蛋白質(zhì)溶液2 mL，再加1 mL5%三氯乙酸溶液，振蕩試管，觀察沉淀的生成。離心傾去上清液，向沉淀中加入少量水，觀察沉淀是否溶解。,4．有機(jī)溶劑沉淀蛋白質(zhì)取1支試管，加入2 mL蛋白質(zhì)溶液，再加入2 mL 95%乙醇?；靹?，觀察沉淀的生成。,5．乙醇引起的變性與沉

9、淀 取3支試管，編號，依下表順序加入試劑：,振搖混勻后，觀察各管有何變化。放置片刻，向各管內(nèi)加水8 mL。在2、3號管中各加一滴甲基紅，分別用0.1 M醋酸溶液及0.05 M碳酸鈉溶液中和。觀察顏色的變化和沉淀的生成。每管再加0.1 M鹽酸溶液數(shù)滴，觀察沉淀的再溶解。解釋各管發(fā)生的全部現(xiàn)象。,提示：卵清蛋白等電點4.7,實驗結(jié)果與分析：按照實驗報告要求記錄實驗結(jié)果并分析。研討：通過本次實驗，有否對該項目改進(jìn)的合理建議。

10、解釋鹽析、有機(jī)溶劑、等電點、重金屬、有機(jī)酸沉淀蛋白質(zhì)的不同機(jī)理。查閱資料，介紹蛋白質(zhì)等電點的測定方法。查閱資料，介紹生物大分子制備常用的沉淀方法。蛋白質(zhì)變性有哪些方面的應(yīng)用？大組總結(jié)交流（PPT）：內(nèi)容：實驗結(jié)果與分析，課后研討題，實驗體會等。,五、實驗結(jié)果與報告,實驗結(jié)果,,（一）酪蛋白等電點的測定,,（二）蛋白質(zhì)沉淀實驗,1．蛋白質(zhì)的鹽析,2．重金屬離子沉淀蛋白質(zhì),3．有機(jī)酸沉淀蛋白質(zhì),4．有機(jī)溶劑沉淀蛋白質(zhì),精品課件！,