蛋白質(zhì)沉淀技術(shù)

1、蛋白質(zhì)沉淀技術(shù),一、蛋白質(zhì)的基本性質(zhì),蛋白質(zhì)是人體機(jī)能構(gòu)成成分,人體任何器官和組織都是以蛋白質(zhì)作為重要組成成分。鑒于蛋白質(zhì)重要性研究蛋白質(zhì)分離十分必要。,1、膠體性質(zhì),蛋白質(zhì)表面有一些親水基團(tuán)易起水合作用，從而形成水化層，導(dǎo)致蛋白質(zhì)顆粒不易聚集沉淀，這些蛋白質(zhì)分子直徑在2～20nm范圍，所以蛋白質(zhì)溶液是親水膠體，具有半通透性，丁達(dá)爾效應(yīng)、布朗運(yùn)動(dòng)等一些親水膠體性質(zhì)① 。,[1] 楊豐科.系統(tǒng)有機(jī)化學(xué)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2003

2、·433 一 435.,2、兩性解離和等電點(diǎn),蛋白質(zhì)可解離基團(tuán)包括末端α-氨基和末端α-羧基及可解離側(cè)鏈R基。這些可解離基團(tuán)在特定的PH范圍內(nèi)解離，產(chǎn)生帶正電荷或者帶負(fù)電荷的基團(tuán)。當(dāng)溶液PH使蛋白質(zhì)所帶正電荷與負(fù)電荷恰好相等，即蛋白質(zhì)分子本身凈電荷為零，此時(shí)PH即為該蛋白質(zhì)分子等電點(diǎn)，用PI表示，測PI時(shí)一定在緩沖液中進(jìn)行，因?yàn)殡x子強(qiáng)度可以使PI改變① 。,[1] 楊豐科.系統(tǒng)有機(jī)化學(xué)[M].北京:化學(xué)工業(yè)出版社,2003&#

3、183;433 一 435.,兩性解離和等電點(diǎn),,3、沉淀作用,沉淀是指在溶液中加入沉淀劑使溶質(zhì)溶解度降低，形成固相從溶液中析出從而達(dá)到分離的一種技術(shù)。沉淀分離方法和其他分離方法相比，優(yōu)點(diǎn)是過程簡單、成本低、原料易得，便于小批量生產(chǎn)，在產(chǎn)物濃度愈高的溶液中沉淀越有利、收率越高；缺點(diǎn)為過濾困難、產(chǎn)品質(zhì)量較低，需重新精制。,4、變性作用,天然蛋白質(zhì)受物理或化學(xué)因素影響，蛋白質(zhì)分子內(nèi)部維系其高級(jí)結(jié)構(gòu)原有氫鍵、鹽鍵等次級(jí)鍵遭到破壞，使分子內(nèi)部

4、結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，導(dǎo)致其生物學(xué)性質(zhì)、物理化學(xué)性質(zhì)改變，這種現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)變性作用。,5、凝固作用,變性蛋白質(zhì)分子相互凝聚或相互穿插纏繞在一起的現(xiàn)象稱為蛋白質(zhì)凝固，例如生雞蛋蛋白溶液受熱變?yōu)榈鞍讐K現(xiàn)象。,6、顏色反應(yīng),蛋白質(zhì)顏色反應(yīng)實(shí)際上是氨基酸一些基團(tuán)肽鍵等與一定試劑所產(chǎn)生化學(xué)反應(yīng)。,二、蛋白質(zhì)沉淀分離技術(shù),蛋白質(zhì)膠粒上同性電荷互相排斥，不易凝聚成團(tuán)下沉；蛋白質(zhì)表面許多親水基團(tuán)水合作用形成一層水化膜,在膠粒之間起隔離作用，蛋白質(zhì)在水溶液中,

5、雖分子量很大,但仍能維持穩(wěn)定溶解狀態(tài)。若能除去其水化膜并中和其電荷,則蛋白質(zhì)可從溶液中沉淀而出。常用有以下幾種沉淀方法：,蛋白質(zhì)沉淀分離常用方法,1、鹽析法2、有機(jī)溶劑沉淀法3、等電點(diǎn)沉淀法4、變性沉淀分離技術(shù)5、復(fù)合鹽沉淀法,1、鹽析法（中性鹽沉淀）,一般來說,所有固體溶質(zhì)都可在溶液中加入中性鹽而沉淀析出,這一過程稱之鹽析②。（1）中性鹽沉淀蛋白質(zhì)的基本原理 a.高濃度鹽離子使蛋白質(zhì)表面雙電層厚度降低，靜電排斥作用減弱。

6、 b.中性鹽比蛋白質(zhì)具更強(qiáng)的親水性，因此將與蛋白質(zhì)爭奪水分子。,[2] 李冬梅,張錦茹,田 園.蛋白質(zhì)沉淀分離[J].糧食與油 脂,2007·9 一 11,鹽析法,鹽析機(jī)理示意圖,鹽析法,（2）中性鹽的選擇原則a.要有較強(qiáng)的鹽析效果。 一般來說，陰離子影響鹽析的效果比陽離子顯著，且含高價(jià)陽離子的無機(jī)鹽比含低價(jià)陽離子的無機(jī)鹽效果好。b.要有足夠大的溶解度，且溶解度受溫度影響盡可能地小。 便

7、于獲得高濃度的鹽溶液，尤其是在低溫時(shí)，不至于造成鹽結(jié)晶的析出。c.不影響蛋白質(zhì)等生物大分子的活性，并且，最好不引入給分離或測定帶來麻煩的雜質(zhì)。d.來源豐富，價(jià)格低廉。,鹽析法,常用的中性鹽有：(NH4)2SO4 ，Na2SO4 ，NaH2PO4 等。其中最重要的是(NH4)2SO4。優(yōu)點(diǎn)：①溶解度大 ；尤其是在低溫時(shí)仍有相當(dāng)高的溶解度 ②分離效果好； ③有穩(wěn)定蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的作用，不易引起變性；

8、 ④價(jià)格便宜；廢液可以肥田，不污染環(huán)境。缺點(diǎn)：硫酸銨水解后變酸，在高pH值下會(huì)釋放出氨，腐蝕性 較強(qiáng)，因此，鹽析后要將硫酸銨從產(chǎn)品中除去。,鹽析法,（3）影響鹽析的因素,a.蛋白質(zhì)濃度,一般較適當(dāng)?shù)臉悠窛舛仁?.5%-3.0%，通過實(shí)驗(yàn)確定。,b.離子強(qiáng)度和類型,一般來說,離子強(qiáng)度越大,蛋白質(zhì)溶解度越低。下面為幾種鹽鹽析能力排列次序:磷酸鉀> 硫酸鈉>磷酸銨>檸檬酸鈉>硫酸鎂③,[3] G

9、elazka V B ,Smith D D S ,Ledward D A ,et al .Influence of high pressure on protein-polysaccharide interactions[J] . Pros.Int.Conf ,1998,24:397-400.,鹽析法,c.pH值,一般來說,蛋白質(zhì)所帶凈電荷越多,溶解度越大；凈電荷越少,溶解度越小,在等電點(diǎn)時(shí)蛋白質(zhì)溶解度最小,為提高鹽析效率,多將溶液pH

10、值調(diào)到目的蛋白等電點(diǎn)處。,d.溫度,在低離子強(qiáng)度或純水中,蛋白質(zhì)溶解度在一定范圍內(nèi)隨溫度增加而增加;但在高濃度下,蛋白質(zhì)、酶和多肚類物質(zhì)溶解度隨溫度上升而下降。在一般情況下,蛋白質(zhì)對(duì)鹽析溫度無特殊要求,可在室溫下進(jìn)行,只有某些對(duì)溫度較敏感酶要求在0℃～4℃進(jìn)行。,鹽析法,（4）脫鹽 常用的脫鹽處理方法有：透析法、超濾及凝膠過濾法。透析最早應(yīng)用的膜分離技術(shù)。,2、有機(jī)溶劑沉淀法,（1）有機(jī)溶劑沉淀機(jī)理：降低水的介電常數(shù),導(dǎo)致具有表面水

11、層的生物大分子脫水,相互聚集,最后析出。該法優(yōu)點(diǎn)在于：a.分辨能力比鹽析法高,即蛋白質(zhì)只在一個(gè)較窄有機(jī)溶劑濃度下沉淀;b.沉淀不用脫鹽，過濾較為容易。其缺點(diǎn)是對(duì)具有生物活性大分子易引起變性失活,操作要求在低溫下進(jìn)行?？傮w來說,有機(jī)溶劑沉淀法不如鹽析法普遍② 。,[2] 李冬梅,張錦茹,田 園.蛋白質(zhì)沉淀分離[J].糧食與油 脂,2007·9 一 11,有機(jī)溶劑沉淀法,(2)有機(jī)沉淀劑有機(jī)沉淀劑有乙醇、甲醇、丙酮、二

12、甲基甲酰胺、二甲基亞砜、異丙酮等, 其中最常用的是乙醇和丙酮。蛋白質(zhì)和酶的沉淀大多采用乙醇, 由于甲醇、丙酮均有一定毒性, 故使用時(shí)必須謹(jǐn)慎。,有機(jī)溶劑沉淀法,(3)有機(jī)沉淀劑分離技術(shù)的影響因素,,有機(jī)溶劑沉淀法,(4) 應(yīng)用實(shí)例應(yīng)用實(shí)例有高粱蛋白質(zhì)的提取, 其基本工藝流程為: 高梁粉→萃取→離心→沉淀→水洗→烘干[4],[4] 張偉敏,譚小蓉,鐘 耕.高粱蛋白質(zhì)研究進(jìn)展[J].糧食與油脂,2005(1):7- 9.,3、等電點(diǎn)沉淀

13、法,（1）等電點(diǎn)沉淀法的原理,等電點(diǎn)(pI)是兩性物質(zhì)在其質(zhì)點(diǎn)的凈電荷為零時(shí)介質(zhì)的pH值,溶質(zhì)凈電荷為零，分子間排斥電位降低，吸引力增大，能相互聚集起來，沉淀析出，此時(shí)溶質(zhì)的溶解度最低。,等電點(diǎn)沉淀法,（2）等電點(diǎn)沉淀法的影響因素,a.雜質(zhì)種類的影響混合液中存在許多等電點(diǎn)相近的兩性電解質(zhì)，單獨(dú)使用此法效果差。b.離子強(qiáng)度的影響蛋白質(zhì)有鹽溶和鹽析兩面性，等電點(diǎn)的數(shù)值隨著溶液中中性鹽離子的種類和濃度變化而變化，所以離子強(qiáng)度對(duì)等電點(diǎn)的沉

14、淀作用影響較大。c.溶質(zhì)表面極性的影響等電點(diǎn)沉淀法適合于疏水性較大的蛋白質(zhì)（如酪蛋白），因其表面水化層相對(duì)較薄。而親水性較強(qiáng)的蛋白質(zhì)在等電點(diǎn)下不容易產(chǎn)生沉淀，這時(shí)需要結(jié)合其他方法一起使用。,等電點(diǎn)沉淀法,(3) 應(yīng)用實(shí)例,應(yīng)用實(shí)例有大豆蛋白的 堿提酸沉法, 基本工藝流程為: 豆粕原料→二次堿提→粗濾→酸沉→打漿→回調(diào)→改性→噴粉→成品[5],[5] 高孔榮, 黃惠華, 梁照為. 食品分離技術(shù)[ M ] . 廣州: 華南理工大學(xué)出版

15、社, 1998: 12- 15.,4、變性沉淀分離技術(shù),（1）基本原理,利用生物大分子物質(zhì)對(duì)物理、化學(xué)等外部環(huán)境因子敏感性的差異而選擇性地使一種組分發(fā)生變性形成沉淀, 而另一些組分保持不變, 從而達(dá)到分離、除雜和提純的目的。,變性沉淀分離技術(shù),（2）變性沉淀分離的方法,a.熱變性沉淀分離: 利用蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性不同的特點(diǎn), 使蛋白質(zhì)組分之間得以分離, 同時(shí)使蛋白質(zhì)與水及其他可溶物分離, 此法常用于組織化植物蛋白的生產(chǎn)[6] 。,[6] 張

16、建云, 邱 堅(jiān), 李正紅,等.木豆葉蛋白提取工藝研究[J] .西南林學(xué)院學(xué)報(bào), 2001, 21( 1) : 40- 44.,變性沉淀分離技術(shù),b.選擇性酸堿變性沉淀分離:利用酸堿變性原理, 通過調(diào)節(jié)溶液 pH 值, 可有選擇地去除雜蛋白, 常用于生化制備中[7] 。,c.利用酶進(jìn)行變性分離:利用酶的催化作用使一些蛋白質(zhì)變性, 從而沉淀分離, 如凝乳酶催化牛乳酪蛋白的沉淀。,[7] 劉 芳, 敖常偉. 刺槐葉蛋白提取工藝條件的初步研究[

17、J] . 中南林學(xué)院學(xué)報(bào), 1999, 19( 1) : 64- 67.,變性沉淀分離技術(shù),d.利用表面活性劑或有機(jī)溶劑引起變性沉淀分離: 在制備核酸時(shí), 可加入含水酚、氯仿以及十二烷基磺酸鈉等試劑, 有選擇地使蛋白質(zhì)發(fā)生變性沉淀, 達(dá)到去除雜質(zhì)、提純核酸的目的。,變性沉淀分離技術(shù),(3)影響蛋白質(zhì)變性的因素,a.溫度。在較高溫度作用下, 蛋白質(zhì)的二級(jí)、三級(jí)和四級(jí)結(jié)構(gòu)的弱鍵斷裂, 破壞了肽鏈原來特有的排列和空間結(jié)構(gòu), 使原來在

18、大分子內(nèi)部的極性基團(tuán)轉(zhuǎn)到分子表面, 促進(jìn)蛋白質(zhì)分子相互凝集而沉淀, 但溫度過高又會(huì)使蛋白質(zhì)發(fā)生變性。,變性沉淀分離技術(shù),b.pH值。大部分蛋白質(zhì)在 pH 4～10 的范圍內(nèi)是比較穩(wěn)定的,超過這個(gè)范圍強(qiáng)酸或強(qiáng)堿會(huì)使蛋白質(zhì)分子內(nèi)的基團(tuán)帶電性質(zhì)發(fā)生變化, 從而破壞靜電引力所形成的鍵,使原來的構(gòu)象發(fā)生變化, 導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性c.其他化學(xué)因子。,5、鹽復(fù)合物沉淀法,a. 金屬復(fù)合鹽法:許多有機(jī)物質(zhì)包括蛋白質(zhì)在內(nèi),在堿性溶液中帶負(fù)電荷,能與金

19、屬離子形成沉淀。根據(jù)有機(jī)物與它們之間作用機(jī)制,可分為羧酸、胺及雜環(huán)等含氮化合物,如銅、鋅、鍋;親羧酸疏含氮化合物類,如鈣、鎂、鉛;親硫氫基化合物類,如汞、銀、鉛等。蛋 白質(zhì)一金屬離子復(fù)合物重要性質(zhì)是對(duì)溶液介電常數(shù)非常敏感,調(diào)整水溶液介電常數(shù)(如加入有機(jī)溶劑),即可沉淀多種蛋白。,復(fù)合鹽沉淀法,b.有機(jī)鹽法:含氮有機(jī)酸如苦味酸、苦酮酸、靴酸等能與有機(jī)分子堿性功能團(tuán)形成復(fù)合物而沉淀析出。但此法常發(fā)生不可逆沉淀反應(yīng),故用于制備蛋白質(zhì)時(shí),需采用