牙周病微環(huán)境對SMS誘導(dǎo)的hPDLSCs增殖分化能力和細(xì)胞骨架重組的影響及機(jī)制研究.pdf

1、錯合畸形是普遍存在于口腔中的伴有不同程度牙列不齊和（或）上下牙弓關(guān)系不調(diào)的狀態(tài)；這種存在于口腔內(nèi)的不調(diào)關(guān)系不僅影響日常生理功能，還會一定程度影響患者的面部美觀，畸形嚴(yán)重者甚至干擾人們的心理健康和正常社會交往。因而，前來正畸治療的患者特別是成人患者逐年增多，以求改善口腔生理功能和實現(xiàn)美觀的要求。而在我國，成人患牙周病的患病率高達(dá)80％以上。牙周病是由口腔內(nèi)的致病菌感染引起的一種慢性進(jìn)行性性疾病，對牙周組織造成的不可逆性損害使其位居牙齒缺失

2、的原因之首。因而治療牙周病的首要任務(wù)是炎癥的控制，同時近年來組織工程技術(shù)的突破性發(fā)展也為治療提供了更多的思路。自2004年Seo發(fā)現(xiàn)牙周膜中存在著干細(xì)胞并且鑒定出其具有間充質(zhì)干細(xì)胞特性后，牙周膜干細(xì)胞（ human periodontal mesenchymal stem cells）作為一種重要的種子細(xì)胞很快應(yīng)用于牙周缺損修復(fù)之中。然而hPDLSCs所處的微環(huán)境對于其干性的發(fā)揮有著不可忽略的作用，研究發(fā)現(xiàn)TNF-α，IL-1β等炎癥因

3、子會對hPDLSCs細(xì)胞有絲分裂，多向分化潛能造成一定損害。而處于炎癥微環(huán)境中的hPDLSCs對正畸力的反應(yīng)也不同，課題組前期研究也證實了這一結(jié)論，適宜于健康牙周組織的靜態(tài)牽張力（static mechanical strain，SMS）會對牙周病來源hPDLSCs的干細(xì)胞性能產(chǎn)生明顯的抑制作用，但其對PPDLSCs產(chǎn)生這種效應(yīng)的可能機(jī)制仍未知。同時查閱文獻(xiàn)還發(fā)現(xiàn)，機(jī)械應(yīng)力和炎癥微環(huán)境也會影響細(xì)胞內(nèi)網(wǎng)絡(luò)框架結(jié)構(gòu)——細(xì)胞骨架（cytosk

4、eleton）的代謝，進(jìn)而影響細(xì)胞的增殖分化，收縮與遷徙，物質(zhì)運(yùn)輸?shù)裙δ堋Ｑ芯恳炎C實Rho家族蛋白小分子扮演著真核細(xì)胞骨架重組分子開關(guān)的角色，是其最重要的信號通路。但Rho通路是否影響炎癥來源的hPDLSCs間充質(zhì)性能以及這種影響與機(jī)械應(yīng)力作用下細(xì)胞骨架重組相關(guān)性的研究仍然未知。
　　為了較深入研究靜態(tài)牽張力誘導(dǎo)的炎癥hPDLSCs細(xì)胞骨架重排及其對炎癥hPDLSCs干細(xì)胞特性的調(diào)控的可能機(jī)制，這將會為具有牙周健康問題的患者仍然可

5、以實現(xiàn)正畸治療的目的提供臨床依據(jù)。
　　研究內(nèi)容：
　　本研究主要包括三個實驗，實驗一：HPDLSCs/PPDLSCs的培養(yǎng)，鑒定及SMS加載裝置的初步構(gòu)建。主要包括兩種微環(huán)境來源hPDLSCs形態(tài)學(xué)觀察，干細(xì)胞表明標(biāo)記物觀察，細(xì)胞增殖和分化能力檢測及加載系統(tǒng)的初步構(gòu)建。實驗二：12%靜態(tài)牽張力對HPDLSCs/PPDLSCs分化及細(xì)胞骨架重排的影響。實驗三：Rho/ROCK通路對12%靜態(tài)牽張力誘導(dǎo)的的HPDLSCs/PP

6、DLSCs成骨分化及其與細(xì)胞骨架重組相關(guān)性的研究。
　　研究方法：
　　1)低密度稀釋法傳代培養(yǎng)HPDLSCs/PPDLSCs，流式細(xì)胞儀確定細(xì)胞間充質(zhì)來源，克隆形成和MTT試驗檢測細(xì)胞再生活性，然后茜素紅和油紅O染色分別檢測成骨和成脂分化潛力，按照FX-4000T系統(tǒng)說明書進(jìn)行0.1Hz，12%，12h SMS加載，初步觀察兩種細(xì)胞。
　　2)加力條件下，利用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期；ALP染色和ALP活性檢測，茜素紅

7、染色檢測HPDLSCs/PPDLSCs成骨分化；FITC-鬼筆環(huán)鈦免疫熒光染色和共聚焦顯微鏡檢測觀察細(xì)胞骨架，Western Blot檢測ALP，Runx2和細(xì)胞骨架調(diào)節(jié)蛋白Rho-A，ROCK1，p-cofilin，cofilin，Rho-GDIα的表達(dá)水平。
　　3)利用Y27632特異性抑制Rho通路信號的傳導(dǎo)，流式細(xì)胞儀檢測12%SMS加載下
　　HPDLSCs/PPDLSCs細(xì)胞周期;茜素紅染色和Western B

8、lot檢測成骨分化變化;FITC-鬼筆環(huán)鈦免疫熒光染色和CLSM觀察細(xì)胞骨架重排，Western Blot檢測骨架調(diào)控蛋白表達(dá)情況。
　　實驗結(jié)果：
　　1.分別從健康和炎癥牙周膜組織中成功分離并培養(yǎng)成hPDLSCs，兩種細(xì)胞均大致呈梭形，漩渦或放射狀排列；二者均強(qiáng)表達(dá)間充質(zhì)表面標(biāo)記物CD29，CD90， CD146，而對于CD31和CD14呈現(xiàn)低表達(dá)狀態(tài)；而PPDLSCs克隆形成率為73%遠(yuǎn)高于HPDLSCs的47%，而細(xì)

9、胞活性均強(qiáng)于HPDLSCs，并且在第5天和第6天時活性明顯增強(qiáng)；然而，經(jīng)過成骨/成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)的HPDLSCs礦化結(jié)節(jié)的形成數(shù)量較多，體積較大而且染色較深；PPDLSCs礦化結(jié)節(jié)染色分散，體積小，染色較淺。HPDLSCs形成更多的脂滴，面積較大且聚集分布；PPDLSCs脂滴面積小且稀疏分布。12%SMS加載后，HPDLSCs較加力前更為細(xì)長，呈柵欄狀彼此平行排列趨勢，且細(xì)胞長軸與牽張力加載方向垂直排列，細(xì)胞體邊緣偽足減少，PPDLSCs細(xì)

10、胞稍顯不規(guī)則，部分細(xì)胞邊緣有凹陷產(chǎn)生，細(xì)胞稍顯圓潤，不規(guī)則細(xì)胞比例增加。
　　2.流式細(xì)胞儀結(jié)果顯示，靜置組，PPDLSCs細(xì)胞增殖指數(shù)（PI=G2+S）明顯高于HPDLSCs；而12%SMS加載后，HPDLSCs較加力前PI指數(shù)明顯增加，PPDLSCs較加力前和加力組HPDLSCs的PI值明顯下降。分化能力檢測結(jié)果顯示，靜置組， PPDLSCs的ALP染色，茜素紅染色， ALP活性，油紅O染色均弱于HPDLSCs，且前者礦化結(jié)節(jié)

11、和紅色脂滴面積小，稀疏分布，；12%SMS組， PPDLSCs較靜置組ALP活性進(jìn)一步減小，ALP染色，茜素紅染色和油紅O染色更淺，而HPDLSCs較靜置組，ALP活性明顯增加，ALP和茜素紅染色明顯加深，呈磚紅色，鏡下礦化結(jié)節(jié)和脂滴形成增多，脂滴間相互融合，呈片分布。Western Blot檢測加力前后ALP和Runx2蛋白水平變化，其結(jié)果大體與茜素紅染色和油紅O染色結(jié)果一致。ALP和Runx2蛋白的表達(dá)相同處理組PPDLSCs表達(dá)明

12、顯弱于HPDLSCs，12%下調(diào)PPDLSCs而明顯上調(diào)HPDLSCs的ALP， Runx2蛋白的表達(dá)。LSCM觀察細(xì)胞骨架的改變，發(fā)現(xiàn)靜置組PPDLSCs和HPDLSCs細(xì)胞內(nèi)的骨架纖維均彼此交錯排列呈網(wǎng)狀，但PPDLSCs胞內(nèi)應(yīng)力纖維的數(shù)量明顯較HPDLSCs少，且纖維的較纖細(xì)，不如HPDLSCs粗壯清晰；而12%SMS組，PPDLSCs胞體周圍皺縮，骨架微絲變得更加的纖細(xì)，形態(tài)模糊， F-actin的排列方式較為隨意；而HPDLS

13、Cs胞體被拉伸，出現(xiàn)明顯的細(xì)胞骨架重排現(xiàn)象，與細(xì)胞體的變化趨勢大體一致，即骨架微絲沿著細(xì)胞長軸方向彼此平行排列，與牽張力方向垂直，骨架纖維也更為致密。蛋白定量分析顯示，靜置組PPDLSCs中Rho-A， ROCK1， p-cofilin蛋白表達(dá)均不同程度的小于HPDLSCs，而cofilin，Rho-GDIα水平略高。加力組，PPDLSCs中Rho-A， ROCK1，cofilin表達(dá)水平進(jìn)一步下調(diào)，p-cofilin，Rho-GDIα

14、水平升高，甚至高于加力組的HPDLSCs二者的表達(dá)水平；HPDLSCs施加12%SMS后，Rho-A， ROCK1，p-cofilin明顯升高。
　　3.應(yīng)用Y27632預(yù)處理PPDLSCs和HPDLSCs，細(xì)胞周期檢測顯示，PPDLSCs靜置組DMSO加力組>Y27632加力組；HPDLSCs PI值依次為：DMSO加力組>Y27632加力組>靜置組。成骨誘導(dǎo)

15、后，PPDLSCs茜素紅染色及ALP，Runx2蛋白定量水平與細(xì)胞周期檢測結(jié)果一致；而對于HPDLSCs，DMSO加力組染色最明顯，形成的礦化結(jié)節(jié)最多，面積大且染色最深，而對于靜置組和Y27632加力組，HPDLSCs鈣化結(jié)節(jié)的形成基本無差別，成骨蛋白ALP的表達(dá)由高到低依次為DMSO加力組>靜置組>Y27632加力組；Runx2蛋白的表達(dá)依次為DMSO加力組>Y27632加力組>靜置組；相同處理組內(nèi)PPDLSCs茜素紅染色，鈣化結(jié)節(jié)量

16、，成骨蛋白表達(dá)均弱于HPDLSCs。對細(xì)胞骨架進(jìn)行觀察和蛋白分析顯示，對于PPDLSCs而言，Y27632的加入較DMSO加力組進(jìn)一步抑制了12%SMS誘導(dǎo)的細(xì)胞形態(tài)學(xué)的改變及細(xì)胞骨架的重組，hPDLSCs細(xì)胞體積減小，變得較為圓潤，失去原有的梭形形態(tài)，細(xì)胞邊緣出現(xiàn)向細(xì)胞質(zhì)凹陷的情況，細(xì)胞骨架雜亂無序，稀疏排列，而蛋白分析顯示，DMSO加力組ROCK1，p-cofilin，Rho-A蛋白水平下調(diào)，而負(fù)向調(diào)節(jié)蛋白cofilin，Rho-G

17、DIα水平高于靜置組；對于HPDLSCs，Y27632的加入使得細(xì)胞出現(xiàn)類似與PPDLSCs的情況，但不同之處在于HPDLSCs較實驗組PPDLSCs細(xì)胞體積較大，細(xì)胞稍細(xì)長，細(xì)胞邊緣凹陷程度也不如PPDLSCs明顯，Y27632的干預(yù)同樣使得12%SMS介導(dǎo)的ROCK1，p-cofilin，Rho-A的表達(dá)受到抑制，同時cofilin，Rho-GDIα的表達(dá)反而增強(qiáng)。
　　實驗結(jié)論：
　　1.炎癥微環(huán)境可一定程度上提高h(yuǎn)P