菌種保藏

1、微生物實驗菌種保藏方案微生物實驗菌種保藏方案一、石蠟油低溫保藏法一、石蠟油低溫保藏法本方法的原理是在長好的斜面菌上覆蓋滅菌的液體石蠟，達到菌體與空氣隔絕，使菌處于生長和代謝停止?fàn)顟B(tài)，同時石蠟油還防止水分蒸發(fā)，在低溫下達到較長期的保藏菌種的目的。保藏溫度要求在4～4℃下。液體石蠟法適用于不產(chǎn)孢子的菌種。具體操作是：菌種為斜面培養(yǎng)菌種，斜面不宜過長；選擇純凈優(yōu)質(zhì)石蠟油，置三角燒瓶中經(jīng)過121℃高壓蒸汽滅菌1～2h，將其放烘箱中(160℃左右

2、)干熱處理，去除滅菌時滲入的水分，待石蠟油變得清澈透明后冷卻即可加入斜面，斜面上不能出現(xiàn)氣泡，液蠟添加量以高出斜面頂部約1cm為宜。二、甘油管冷凍保藏法二、甘油管冷凍保藏法1試驗方法介紹本法也是利用微生物在甘油中生長和代謝受到抑制的原理達到保藏目的。其方法是，將80%的甘油高壓蒸汽滅菌待用。將培養(yǎng)好的斜面菌種用無菌水制成高濃度的菌懸液(108～1010ml)。取1ml滅菌甘油放入與甘油充分混勻，使甘油濃度約為10%30%，于70℃下凍存

3、。20℃保存時間較短?；虿捎皿w積比為8：2的甘油－生理鹽水，加入新鮮培養(yǎng)的菌體肉湯，混合均勻后至20℃冰箱保存。2效果該法適用于一般細(xì)菌的保存，同時也適用于鏈球菌、弧菌、真菌等需特殊方法保存的菌種，適用范圍廣，操作簡便，效果好，無變異現(xiàn)象發(fā)生。甘油－生理鹽水保存液保存菌種優(yōu)于甘油原液，其原因可能是加入生理鹽水適當(dāng)降低了甘油的高滲作用，且有肉湯培養(yǎng)物適量增加保存液的營養(yǎng)成分，從而更好地保護了待保存的菌株。三、真空冷凍干燥法三、真空冷凍干燥

4、法1試驗原理真空冷凍干燥保藏法是兼具低溫、干燥、除氧三方面菌種保藏的主要因素，除不宜于絲狀真菌的菌絲體外，對病毒、細(xì)菌、放線菌、酵母及絲狀菌孢子等各類微生物都適用，不宜用凍干法保存的微生物不到2%。冷凍干燥法是在低溫下快速將細(xì)胞凍結(jié)，然后在真空條件下干燥，使微生物的生長和酶活動停止。為了防止在冷凍和水分升華過程中對細(xì)胞的損害，要采用保護劑來制備細(xì)胞懸液，使菌在凍結(jié)和脫水過程中起到保護作用的溶質(zhì)，通過氫鍵和離子鍵對水和細(xì)胞所產(chǎn)生的親和力來

5、穩(wěn)定細(xì)胞成分的構(gòu)型。即是使樣品中的水分在冰凍狀態(tài)下，抽真空減壓，使凍結(jié)的冰直接升華為水蒸氣，使樣品達到干燥。干燥后的微生物在真空下封裝，與空氣隔絕，達到長期保藏的目的。2試驗步驟1）安瓿管準(zhǔn)備選取規(guī)格約直徑為8mm，高100mm的中性玻璃安瓿管，先用2%鹽酸浸泡8～10h，再經(jīng)自來水沖洗多次，用蒸餾水涮洗2～3次，烘干；在每管內(nèi)放入打好菌號及日期的標(biāo)簽，字面朝向管壁，管口塞好棉塞，滅菌備用。在凍干后應(yīng)立即在真空下融封，才有利于長期保存

6、。⑤溫度的影響在干燥和真空狀況下溫度的影響遠沒有上述幾項因素重要，因此可以在室溫下保存，但許多微生物在4℃保存的存活率要比在室溫下高1倍。⑥含水量的影響：水分含量過高對菌存活不利，完全脫水也不利于保存，一般把干燥后的細(xì)胞含水量控制在3%以下(1%～3%)。⑦復(fù)蘇培養(yǎng)：打開安瓿管后加入無菌水使凍干菌融化，融化速度慢比快速融化的成活率要高。菌種能否適宜于凍干保存，需經(jīng)過實驗來證明，一般是在保存1個月進行復(fù)蘇培養(yǎng)，如果菌的成活率高于10

7、%，即認(rèn)為可用凍干保存法保存，以后6個月、2年、5年、10年再進行檢查存活情況，以確定保存期的上限。凍干保藏的效果因微生物種類而異，一般是細(xì)菌＞放線菌＞真菌＞藻類，而菌絲體不宜用此法保存。3試驗效果冷凍干燥保存的菌種存活時間長、效果好，一般菌種可保存5年以上，有的可保藏15年以上不發(fā)生變異。還具有體積小、不易污染、便于運輸?shù)葍?yōu)點，是一種用得最為廣泛的菌種保藏方法。4試驗儀器及試劑冷凍干燥備有不同型號和類型，但都由四個部分組成：干燥箱

8、、蒸汽捕集器、真空泵、冷凍系統(tǒng)。干燥箱可控制溫度范圍為40～40℃。四、液氮超低溫保存四、液氮超低溫保存1試驗原理本方法是近年推廣使用的一種菌種保存法。大多數(shù)微生物如病毒、噬菌體，立克氏體，各種細(xì)菌、放細(xì)菌、支原體，各種絲狀菌、酵母、藻類和原蟲，特別是一些無法用凍干保存的微生物，都可用此法長期保存。工業(yè)微生物高產(chǎn)菌種也逐步采用此法保存。液氮保存的原理是微生物在130℃以下溫度時，它的新陳代謝作用停止，化學(xué)反應(yīng)也消失，而液氮溫度可達

9、196℃，在這種情況下可以長期保存。2試驗步驟1)安瓿管準(zhǔn)備一般要求用95%料或GG17的玻管制作，以能承受巨大的溫差變化而不破損，大小根據(jù)需要而定。用印同在管壁上書寫菌號，160℃烘干，加棉塞滅菌備用。2)菌種準(zhǔn)備在最適培養(yǎng)基斜面上培養(yǎng)得到健壯菌種，制成懸浮液，如為不產(chǎn)孢子的真菌，則采用斜面或液體振蕩培養(yǎng)，制成菌絲片段。將菌懸淮分裝至滅菌安瓿管中，每管0.2～0.5ml，然后用火焰將安瓿熔封。3)凍結(jié)將熔封后的安瓿管入大慢速凍結(jié)器