菌種保藏

1、菌種的保藏菌種是一個(gè)國(guó)家所擁有的重要生物資源，菌種保藏（preservation）是一項(xiàng)重要的微生物學(xué)基礎(chǔ)工作。菌種保藏機(jī)構(gòu)的任務(wù)是在廣泛收集實(shí)驗(yàn)室和生產(chǎn)菌種、菌株（包括病毒株甚至動(dòng)、植物細(xì)胞株和質(zhì)粒等）的基礎(chǔ)上，將它們妥善保藏，使之達(dá)到不死、不衰、不亂以及便于研究、交換和使用的目的。為此，在國(guó)際上一些工業(yè)較發(fā)達(dá)的國(guó)家中都設(shè)有相應(yīng)的菌種保藏機(jī)構(gòu)。例如：中國(guó)微生物菌種保藏委員會(huì)（CCCCM），美國(guó)典型菌種保藏中心（ATCC），美國(guó)的“北部

2、地區(qū)研究實(shí)驗(yàn)室”（NRRL），荷蘭的霉菌中心保藏所（CBS），英國(guó)的國(guó)家典型菌種保藏所（NCTC），蘇聯(lián)的全蘇微生物保藏所（UCM）以及日本的大阪發(fā)酵研究所（IFO）等都是有關(guān)國(guó)家有代表性的菌種保藏機(jī)構(gòu)。菌種保藏的具體方法很多，原理卻大同小異。首先要挑選典型菌種（typeculture）的優(yōu)良純種，最好采用它們的休眠體（如分生孢子、芽孢等）；其次，還要?jiǎng)?chuàng)造一個(gè)適合其長(zhǎng)期休眠的環(huán)境條件，諸如干燥、低溫、缺氧、避光、缺乏營(yíng)養(yǎng)以及添加保護(hù)劑或

3、酸度中和劑等。水分對(duì)生化反應(yīng)和一切生命活動(dòng)至關(guān)重要，因此，干燥尤其是深度干燥，在保藏中占有首要地位就不言而喻了。五氧化二磷、無(wú)水氯化鈣和硅膠是良好的干燥劑，當(dāng)然，高度真空還可同時(shí)達(dá)到驅(qū)氧和深度干燥的雙重目的。除水分外，低溫乃是保藏中的另一重要條件。微生物生長(zhǎng)的溫度低限約在30℃，可是，在水溶液中能進(jìn)行酶促反應(yīng)的溫度低限則在140℃左右。這或許就是為什么在有水分的條件下，即使把微生物保藏在較低的溫度下，還是難以較長(zhǎng)期地保藏它們的一個(gè)主要原

4、因。在低溫保藏中，細(xì)胞體積較大者一般要比較小者對(duì)低溫更為敏感，而無(wú)細(xì)胞壁者則比有細(xì)胞壁者敏感。其原因同低溫會(huì)使細(xì)胞內(nèi)的水分形成冰晶，從而引起細(xì)胞結(jié)構(gòu)尤其是細(xì)胞膜的損傷有關(guān)。如果放到低溫（不是一般冰箱）下進(jìn)行冷凍時(shí)，適當(dāng)采用速凍的方法，可因產(chǎn)生的冰晶小而可減少對(duì)細(xì)胞的損傷。當(dāng)從低溫下移出并開(kāi)始升溫時(shí)，冰晶又會(huì)長(zhǎng)大，故快速升溫也可減少對(duì)細(xì)胞的損傷。當(dāng)然，不同微生物的最適冷凍速度和升溫速度也是不同的。例如，酵母的冷凍速度以每分鐘10℃為宜，而

5、紅細(xì)胞則相應(yīng)地為2000℃。冷凍時(shí)的介質(zhì)對(duì)細(xì)胞損傷與否也有顯著的影響。例如，0.5mol／L左右的甘油或二甲亞砜可透入細(xì)胞，并通過(guò)降低強(qiáng)烈的脫水作用而保護(hù)細(xì)胞；大分子物質(zhì)如糊精、血清白蛋白、脫脂牛奶或聚乙烯吡咯烷酮（PVP）雖不能透入細(xì)胞，但可能是通過(guò)與細(xì)胞表面結(jié)合的方式而防止細(xì)胞膜受凍傷。在實(shí)踐中，發(fā)現(xiàn)用較低的溫度進(jìn)行保藏時(shí)效果更為理想，如液氮溫度（195℃）比干冰溫度（70℃）好，70℃又比20℃好，而20℃則比4℃好。一種良好的保

6、藏方法，首先應(yīng)能保持原菌的優(yōu)良性狀不變，同時(shí)還須考慮方法的通用性和操作的簡(jiǎn)便性。具體的菌種保藏方法很多，其原理和應(yīng)用范圍各有側(cè)重，優(yōu)缺點(diǎn)也有所差別。在國(guó)際著名的美國(guó)ATCC（AmericanTypeCultureCollection）中，目前已改為僅采用兩種最有效的方法，即保藏期一般達(dá)5～15年的冷凍干燥保藏法和保藏期一般達(dá)20年以上的液氮保藏法，以達(dá)到最大限度地減少傳代次數(shù)和避免菌種衰退的目的。保藏原理是這樣的：當(dāng)菌種保藏單位收到合適

7、菌種時(shí)，先將原種保藏原理是這樣的：當(dāng)菌種保藏單位收到合適菌種時(shí)，先將原種制成若干液氮保藏管作為保藏菌種，然后再制一批冷凍干燥保藏菌制成若干液氮保藏管作為保藏菌種，然后再制一批冷凍干燥保藏菌種作為分發(fā)用。經(jīng)種作為分發(fā)用。經(jīng)5年后，假定第一代（原種）的冷凍干燥保藏菌年后，假定第一代（原種）的冷凍干燥保藏菌種已分發(fā)完畢，就再打開(kāi)一瓶液氮保藏原種，這樣下去，至少在種已分發(fā)完畢，就再打開(kāi)一瓶液氮保藏原種，這樣下去，至少在20多次攪拌，防止局部過(guò)堿

8、或過(guò)酸而導(dǎo)致測(cè)量不準(zhǔn)確和營(yíng)養(yǎng)成分被破壞。1.4加凝固劑配制固體培養(yǎng)基時(shí)需加凝固劑，如瓊脂、明膠等。將凝固劑加入液體培養(yǎng)基中，加熱并不斷攪拌至融解，再補(bǔ)足所蒸發(fā)水分。1.5過(guò)濾分裝在二層紗布中間夾入脫脂棉，將配好的培養(yǎng)基趁熱過(guò)濾并分裝。斜面培養(yǎng)基分裝量約為試管高度的四分之一(4～5mL)，穿刺培養(yǎng)基分裝量以試管高度的二分之一為宜。分裝過(guò)程中勿使培養(yǎng)基沾污管口，以免弄濕棉塞造成污染。1.6包扎標(biāo)記將試管加棉塞，外面包扎一層牛皮紙或鋁箔并注明