沼澤紅假單胞菌phbC-hupL缺失突變株構(gòu)建及產(chǎn)氫特性研究.pdf

1、化石燃料的大量使用造成環(huán)境污染和溫室效應(yīng)日益嚴(yán)重，加上能源短缺的威脅，使得清潔能源的開發(fā)與應(yīng)用成為大勢(shì)所趨。氫能不僅燃燒后的惟一產(chǎn)物為水，而且具有比較高的熱值和較容易轉(zhuǎn)化為其它能源形式等特點(diǎn)，因此被認(rèn)為是最潔凈、最具有開發(fā)潛力的能源之一。生物制氫技術(shù)反應(yīng)條件溫和、能耗低、能妥善解決能源與環(huán)境的矛盾，其中能將太陽能利用、氫能開發(fā)和有機(jī)廢水凈化處理有機(jī)結(jié)合的光合細(xì)菌制氫技術(shù)是一種的低成本、低耗能的氫能生產(chǎn)綠色技術(shù)。光合細(xì)菌中的沼澤紅假單胞菌

2、(Rhodopseudomonas palustris)是一種古老的能夠在光合異養(yǎng)條件下產(chǎn)生氫氣的紫色非硫細(xì)菌，是目前國內(nèi)外比較常用的光合產(chǎn)氫模式菌株。
　　 在光合細(xì)菌的產(chǎn)氫代謝途徑中，固氮酶催化產(chǎn)生氫氣，吸氫酶催化氫生成質(zhì)子和電子重新供給固氮酶，起到回收能量的作用。聚羥基丁酸酯合成酶，其主要作用是把電子還原力以能源物質(zhì)PHB的形式儲(chǔ)存起來。一般說來，H2的分解可以直接減少細(xì)胞的產(chǎn)氫量，而聚羥基丁酸酯（PHB）的積累，會(huì)消耗細(xì)

3、胞內(nèi)的還原力，從而可以間接減少固氮酶產(chǎn)生的氫氣量.本研究利用湖底淤泥分離的沼澤紅假單胞菌(Rhodopseudomonas palustris)CQU01與該菌株吸氫酶基因hupL缺失菌株(Rhodopseudomonas palustris)CQU012作為出發(fā)菌株，分別構(gòu)建聚羥基丁酸酯合成酶基因phbC單突變株及聚羥基丁酸酯合成酶基因phbC與吸氫酶基因hupL雙突變株，以提高其在光照培養(yǎng)條件下的產(chǎn)氫量。
　　 首先PCR擴(kuò)

4、增phbC兩側(cè)的基因片段5′側(cè)翼與3′側(cè)翼作為雙交換時(shí)的同源交換臂，連入pMD18-T載體進(jìn)行測(cè)序驗(yàn)證，pSUP202載體上含有BamH1和HindⅢ酶切位點(diǎn)，通過BamHⅠ和HindⅢ雙酶切并回收大片段載體，將兩目的基因擴(kuò)增產(chǎn)物與大片段載體連接形成前自殺載體‘pSUP202-phbC’。最后將Em紅霉素抗性篩選標(biāo)記片段連入前自殺載體，構(gòu)建出pYMT自殺載體。把載體轉(zhuǎn)化具有接合轉(zhuǎn)移作用的E.coli S17-1中，然后再與沼澤紅假單胞菌

5、混合，利用接合轉(zhuǎn)移作用完成對(duì)目的基因的敲除。最后，經(jīng)PCR篩選驗(yàn)證，成功獲得了沼澤紅假單胞菌phbC單突變株R. Palustris CQU013及phbC-hupL雙突變株R. Palustris CQU014。
　　 在相同條件下，以野生菌株為對(duì)照，測(cè)定了單突變和雙突變菌株的生長特性和產(chǎn)氫特性。結(jié)果顯示出，突變菌株生長曲線與野生菌株有明顯差異。兩個(gè)突變菌株的菌量增加主要發(fā)生在120h以內(nèi)，其后的菌量增加不再明顯，但野生菌株的

6、菌量增加一直持續(xù)到168h，然后開始下降；突變菌株對(duì)數(shù)生長期較野生菌株要長，但是最高生物量卻明顯低于野生菌株。這可能是由于突變工程菌株大量產(chǎn)氫消耗了能量，因此菌株生物量較出發(fā)菌株有一定降低。產(chǎn)氫量測(cè)定的結(jié)果，也顯示出兩株突變菌株的產(chǎn)氫量較野生菌株產(chǎn)氫量有顯著提高。相同發(fā)酵條件下，野生菌株R. Palustris CQU01的產(chǎn)氫量為344mL/L，而單突變株R. Palustris CQU013的產(chǎn)氫量為454mL/L，雙突變株R. P

7、alustris CQU014產(chǎn)氫量為604mL/L，其產(chǎn)氫量分別是野生菌株的1.31和1.76倍。特別是雙突變菌株，可望為微生物光合產(chǎn)氫和工業(yè)廢水的生物治理提供高效工程菌株。
　　 研究顯示出雙突變菌株產(chǎn)氫能力較phbC基因和hupL基因單突變菌株的產(chǎn)氫能力有明顯提高，進(jìn)一步證明兩個(gè)基因都參與了光合產(chǎn)氫代謝過程。雙突變菌株比單突變菌株可以顯著提高菌株產(chǎn)氫量，但是由于細(xì)菌代謝途徑的可變性和多樣性，可能有其他代謝途徑對(duì)兩個(gè)基因敲除