一株產(chǎn)低溫脂肪酶假單胞菌的篩選及產(chǎn)酶條件的優(yōu)化.pdf

1、由于生物圈中超過80％的地方溫度低于5℃，因而在生態(tài)學(xué)上低溫環(huán)境比高溫環(huán)境的影響范圍更廣。包括嗜冷菌和耐冷菌在內(nèi)的低溫微生物廣泛分布于自然界中，目前所有研究過的低溫自然環(huán)境如淡水、海水、海底沉積物、冰川、高山、南北極、深山洞以及人為低溫環(huán)境如冷庫、冷藏與冷凍食品中均存在著低溫微生物，而且微生物的種類豐富多樣。低溫微生物所產(chǎn)的酶大多是低溫酶。低溫酶能在低溫下有效發(fā)揮催化作用的特點，使其在生物工程領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景。因此，對低溫微生物的

2、研究無論在理論上還是實踐上都有重要意義。 本研究從來自華中農(nóng)業(yè)大學(xué)的4處土樣、長江流域武漢沿岸的6處土樣、長江武漢流域的30處水樣和廣西桂林桃花江的45處水樣中共計分離低溫細(xì)菌25株。 產(chǎn)低溫脂肪酶菌株在自然界中分布很廣。油脂水解實驗表明篩選得到25株低溫細(xì)菌中有12株在10℃對油脂具有良好的分解效果，而在37℃分解油脂的能力很差。經(jīng)初篩和搖瓶復(fù)篩確定一株產(chǎn)低溫脂肪酶活力較高的菌株YT34-8作為進(jìn)一步研究的出發(fā)菌株。

3、 菌株YT34-8在LB培養(yǎng)基上15℃培養(yǎng)72 h的菌落白色、圓形、隆起、不透明、表面光滑、濕潤、邊緣波狀，周圍有透明暈圈，直徑約5 mm。菌體革蘭氏陰性、桿狀、能運動。常規(guī)生理生化測試表明，菌株YT34-8兼性厭氧，生長不需要NaCl，最適生長溫度28℃，4℃良好生長，37℃以上不生長，氧化酶反應(yīng)陽性，接觸酶反應(yīng)陽性，明膠液化陽性，水解淀粉陰性，反硝化作用陽性，脂酶陽性，能利用葡萄糖、果糖。經(jīng)過16S rRNA鑒定，與假單胞菌有

4、98％的相似度。結(jié)合形態(tài)學(xué)、生理生化特征和16S rDNA序列分析結(jié)果，初步認(rèn)定菌株YT34-8屬于假單胞菌屬，命名為Pseudomonas sp.YT34-8。 為了提高Pseudomonas sp.YT34-8的低溫脂肪酶產(chǎn)生能力，對該菌的產(chǎn)酶條件進(jìn)行了優(yōu)化。首先結(jié)合單因素實驗結(jié)果和文獻(xiàn)報道，確定了11個影響假單胞菌發(fā)酵產(chǎn)脂肪酶的可能因素，然后采用Plackett-Burman法在這11個影響菌株脂肪酶發(fā)酵的因素中篩選出3個

5、重要影響因素（橄欖油加入量、250 mL搖瓶裝液量、搖瓶轉(zhuǎn)速），最后用響應(yīng)面分析法對這三個重要影響因素進(jìn)行優(yōu)化，確定了最適產(chǎn)酶條件，即：玉米漿，2％；豆餅粉，2.5％；蔗糖，1％；橄欖油，0.57％；MgSO<,4>·7H<,2>O，0.05％；K<,2>HPO<,4>，0.1％；，發(fā)酵溫度，8℃；初始pH，7.0；發(fā)酵時間，48 h；250 mL搖瓶裝液量，21 mL；搖瓶轉(zhuǎn)速，182 r／min。在此條件下，其發(fā)酵液的酶活力可以達(dá)到