嗜水氣單胞菌J-1株luxS基因缺失株的構(gòu)建及特性分析.pdf

1、嗜水氣單胞菌（Aeromonas hydrophila，Ah）是重要的水生病原菌，給水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)造成極大的經(jīng)濟(jì)損失，同時(shí)還是重要的人畜共患病病原菌。該菌的致病性與其產(chǎn)生的毒力因子密切相關(guān)，已知毒力因子有胞外酶、溶血素、腸毒素以及粘附素如菌毛和表面蛋白S層等。這些毒力因子相互協(xié)同作用于機(jī)體，發(fā)揮毒性作用。此過(guò)程受到嚴(yán)格的調(diào)控，群體感應(yīng)系統(tǒng)參與此調(diào)控過(guò)程。
　　 群體感應(yīng)（Quorum Sensing，QS）即細(xì)菌在生長(zhǎng)過(guò)程中通過(guò)一定

2、的信號(hào)分子來(lái)傳遞信息，使細(xì)胞能感知周圍環(huán)境中自己同類的數(shù)量，并據(jù)此調(diào)節(jié)自身基因的表達(dá)，產(chǎn)生特定的行為。群體感應(yīng)細(xì)菌產(chǎn)生、釋放、響應(yīng)的信號(hào)分子命名為自體誘導(dǎo)物（Autoinducer，AI）。本試驗(yàn)根據(jù)已發(fā)表的嗜水氣單胞菌QS相關(guān)基因序列設(shè)計(jì)引物，以J-1株基因組為模板，PCR擴(kuò)增分別得到AI-1合成酶基因ahyI；AI-2合成酶基因luxS、轉(zhuǎn)錄結(jié)合蛋白ahyR基因核苷酸序列。測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)，擴(kuò)增出的3段基因與已測(cè)出全基因組的嗜水氣單胞菌

3、ATCC7966的同源性較高。用根瘤農(nóng)桿菌JZA1（Agrobacterium tumefaciens）檢測(cè)AI-1；哈維氏弧菌BBl70（Vibrio harveyi）檢測(cè)AI-2，結(jié)果均能測(cè)出信號(hào)，說(shuō)明嗜水氣單胞菌可能存在雙組分QS信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)。
　　 AI-1對(duì)嗜水氣單胞菌毒力因子的調(diào)控已有報(bào)道，而luxS為嗜水氣單胞菌ATCC7966株全基因組測(cè)序發(fā)現(xiàn)的S-核糖高半胱氨酸（SRH）裂解酶同源基因，該酶在其他細(xì)菌中被證實(shí)參

4、與催化合成 AI-2。對(duì)于luxS基因在嗜水氣單胞菌中的功能，以及它在QS中扮演何種角色還知之甚少。本試驗(yàn)構(gòu)建了luxS基因缺失株，為下一步分析奠定基礎(chǔ)。根據(jù)ATCC7966的全基因組序列設(shè)計(jì)合成兩對(duì)引物，分別擴(kuò)出luxS基因上下游1000bp左右的序列。選擇合適的酶切位點(diǎn)，在上下游片段中間插入氯霉素抗性基因，構(gòu)建缺失luxS的自殺性質(zhì)粒pHM5（luxS）。將該質(zhì)粒轉(zhuǎn)入E.coli SM10，接合法將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入嗜水氣單胞菌J-1株，在含

5、有氯霉素、頭孢唑啉的培養(yǎng)基上篩選單交換插入株。PCR驗(yàn)證后單交換菌株接入無(wú)NaCl、含20％蔗糖的LB液體培養(yǎng)基中，倍比稀釋后涂濃度20％蔗糖的LB平板，PCR鑒定雙交換缺失株。
　　 luxS基因缺失后發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌生長(zhǎng)較野生株慢。AI-1產(chǎn)生第一個(gè)波峰提前，第二個(gè)波峰升高，說(shuō)明luxS缺失也會(huì)影響信號(hào)分子1的合成，這暗示了QS系統(tǒng)1和QS系統(tǒng)2協(xié)同調(diào)控的功能。缺失luxS后細(xì)菌幾乎不產(chǎn)生AI-2，這確證了LuxS的AI-2合成酶

6、功能。不管是缺失株還是野生株，在血平板和脫脂奶平板上均能產(chǎn)生透明圈，說(shuō)明缺失株產(chǎn)生溶血素和胞外蛋白酶的能力沒(méi)有丟失。隨后的RT-PCR分析發(fā)現(xiàn)，與野生株相比，缺失株在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期和穩(wěn)定期溶血素基因表達(dá)沒(méi)有顯著變化，而絲氨酸蛋白酶基因在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期表達(dá)較高，在穩(wěn)定期顯著降低。這與QS系統(tǒng)1調(diào)控胞外蛋白酶方式一致。全菌蛋白SDS-PAGE比較發(fā)現(xiàn)，缺失株中一個(gè)明顯的蛋白條帶丟失；而上清蛋白SDS-PAGE沒(méi)有發(fā)現(xiàn)蛋白條帶明顯的改變。小鼠攻毒試驗(yàn)