醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)基因診斷與治療

1、傳統(tǒng)的診斷,１、問、望、聽、觸…—經(jīng)驗型判斷的方法。２、化驗/檢驗——細(xì)胞、組織、大分子、小分子、酶、代謝物；微生物、免疫學(xué)、生物化學(xué)、病理學(xué)等。３、影像學(xué)—X線、B超、CT、核磁共振、內(nèi)窺鏡等。４、特殊檢查—染色體檢查、肌電/腦電/心電、骨密度、原子吸收光譜等。,隨著技術(shù)水平的發(fā)展，這些診斷方法也在不斷的提高和完善，在醫(yī)學(xué)實踐中發(fā)揮了巨大的作用。并還將有更先進的方法問世。 但這些方法大多存在一個無法克服的缺陷：不可預(yù)先診

2、斷。,隨著分子生物學(xué)和分子遺傳學(xué)的發(fā)展，越來越多的證據(jù)表明，絕大多數(shù)疾病的發(fā)生和發(fā)展都與患者的遺傳物質(zhì)結(jié)構(gòu)和功能改變有關(guān)，所以遺傳物質(zhì)的檢查越來越顯得必要?；蛟\斷的定義 應(yīng)用分子生物學(xué)方法檢測患者體內(nèi)遺傳物質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能變化而作出的或輔助臨床診斷的技術(shù)，稱為基因診斷。,,,基因診斷具有靈敏度高、特異性強、費用低，并對許多疾病特別是遺傳性疾病做出預(yù)先診斷的優(yōu)點。它是一種極具發(fā)展?jié)摿Φ脑\斷方法。 由于基因診斷發(fā)展的時間不

3、長，人們對于基因，特別是致病基因的了解還有許多空白，因此許多疾病的診斷還主要依靠其他方法。此外，基因診斷的發(fā)展并非取代和拋棄其他方法，而是相互補充，共同發(fā)展。,長期以來，單基因遺傳病的診斷主要靠臨床觀察和一系列生化檢查，但生化學(xué)檢查要求有相應(yīng)基因表達(dá)產(chǎn)物的體液或細(xì)胞，并對基因產(chǎn)物或代謝異常機理有所了解。 但對絕大多數(shù)遺傳病而言，目前還遠(yuǎn)未達(dá)到這種認(rèn)識。,診斷方法的變更,理想的診斷方法是對患者基因或DNA本身直接進行分析，因為這種

4、分析擺脫了上述各種限制。機體各種組織的核細(xì)胞均有全套基因組DNA，可以作為分析的材料，而不必考慮表達(dá)問題，是目前診斷技術(shù)中最具發(fā)展前途的技術(shù)。,基因診斷的對象,1. 病原生物的侵入，如肝炎、艾滋病、支原體、細(xì)菌、寄生蟲。2. 先天遺傳性疾患， 如苯丙酮尿癥、無丙種球蛋白血癥。3. 后天基因突變引起的疾病，如腫瘤。4. 其它，如親子鑒定、個體識別、法醫(yī)物證。,基因診斷的內(nèi)容與疾病相關(guān)的遺傳物質(zhì)改變主要有兩類， 1.遺傳物質(zhì)

5、，即DNA或RNA的水平的變化。 如病毒感染時病毒基因及其轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物在人體內(nèi)的從無到有，某些腫瘤中癌基因表達(dá)水平的從低到高。,,2.遺傳物質(zhì)的結(jié)構(gòu)變化，即基因突變。 如點突變引起的基因失活、染色體轉(zhuǎn)位引起的基因激活或滅活等等。 因此，從理論上說，所有涉及基因結(jié)構(gòu)和功能變化的檢測都屬于基因診斷。,基因診斷的原理 核酸分子雜交是基因診斷的最基本的方法之一。 基本原理是：互補的DNA單鏈能夠在一定條件下結(jié)合成雙

6、鏈，即能夠進行雜交。 這種結(jié)合是特異的，即嚴(yán)格按照堿基互補的原則進行，它不僅能在DNA和DNA之間進行，也能在DNA和RNA之間進行。,用一段已知基因的核酸序列作出探針，與變性后的單鏈基因組DNA接觸時，如果兩者的堿基完全配對，它們即互補地結(jié)合成雙鏈，從而表明被測基因組DNA中含有已知的基因序列。進行基因檢測有兩個必要條件：一是必需的特異的DNA探針；二是必需的基因組DNA。 當(dāng)兩者都變性呈單鏈狀態(tài)時，就能進行分子雜

7、交。,,基因探針 基因探針（probe）就是一段與目的基因或DNA互補的特異核苷酸序列，它可以包括整個基因，也可以僅僅是/基因的一部分；可以是DNA本身，也可以是由之轉(zhuǎn)錄而來的RNA。,DNA探針根據(jù)其來源有3種：1、來自基因組中有關(guān)的基因本身，稱為基因組探針（genomic probe）2、是從相應(yīng)的基因轉(zhuǎn)錄獲得了mRNA，再通過逆轉(zhuǎn)錄得到的探針，稱為cDNa 探針（cDNa probe）。與基因組探針不同的是，cDNA探

8、針不含有內(nèi)含子序列3、可在體外人工合成堿基數(shù)不多的與基因序列互補的DNA片段，稱為寡核苷酸探針,一、探針的 來源：,二、探針的制備 一般是通過分子克?。╩olecular cloning）獲得的。 克隆是指用無性繁殖方法獲得同一個體、細(xì)胞或分子的大量復(fù)制品。,當(dāng)制備基因組DNA探針進，應(yīng)先制備基因組文庫，即把基因組DNA打斷，或用限制性酶作不完全水解，得到許多大小不等的隨機片段，將這些片段體外重組到運載體（噬菌體、質(zhì)粒等）中去

9、，再將后者轉(zhuǎn)染適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞如大腸肝菌，這時在固體培養(yǎng)基上可以得到許多攜帶有不同DNA片段的克隆噬菌斑，通過原位雜交，從中可篩出含有目的基因片段的克隆，然后通過細(xì)胞擴增，制備出大量的探針。,制備cDNA 探針,離純化相應(yīng)mRNA,人工合成寡核苷酸探針,已知蛋白質(zhì)的氨基酸順序量,三、探針的標(biāo)記,為了確定探針是否與相應(yīng)的基因組DNA雜交，有必要對探針加以標(biāo)記，以便在結(jié)合部位獲得可識別的信號,通常采用放射性同位素32P標(biāo)記探針的某種核苷酸α磷

10、酸基。 近年來已發(fā)展了一些用非同位素如生物素、地高辛配體等作為標(biāo)記物的方法。但都不及同位素敏感。,最常用的探針標(biāo)記法,缺口平移法(nick translation)，,隨機引物法： 即向變性的探針溶液加入6個核苷酸的隨機DNA小片段，作為引物，當(dāng)后者與單鏈DNA互補結(jié)合后，按堿基互補原則不斷在其3’OH端添加同位素標(biāo)記的單核苷酸，這樣也可以獲得比放射性很高的DNA探針。,限制性核酸內(nèi)切酶,限制性核酸內(nèi)切酶（restri

11、ction endonuclease），又簡稱限制酶或內(nèi)切酶。它們是基因工程和基因診斷重要的一類工具酶。 限制酶能特異地識別和切割特異的核苷酸序列，將雙鏈DNA切成較小的片段。酶切后目的基因可能完整地或部分地保存于某一DNA片段上，并被分離出來。,每種限制酶識別和切割的通常為4-6個核苷酸序列,稱為限制性位點(restriction sites)或切點。 限制酶切割雙鏈DNA的方式有兩種，產(chǎn)生的末端也有兩種： 第

12、一種是交錯切割，即兩條鏈的切點不在同一水平而是相隔數(shù)個堿基，故斷口產(chǎn)生兩小段自身互補的單鏈，這種末端容易互補連接，稱為粘性末端（cohesive terminus）；,限制性位點,第二種為平整切割 ，即兩條鏈在同一水平切開，得到平齊末端（blunt terminus）。,5′…GAATTC…3′3′…CTTAAG…5′,,,5′…GGCC…3′3′…CGCG…5′,由于具有相同粘性末端的DNA片段在DNA連接酶的作用下很容易共價連接

13、，因此被廣泛地應(yīng)用于重組DNA操作中。具有相同平齊末端的DNA片段也可以連接，但連接效率只有粘性末端連接效率的1％。,常用基因診斷的技術(shù),1. Hybridization2.聚合酶鏈反應(yīng) PCR3.限制性片段長度多態(tài)性 RFLP4.擴增片段長度多態(tài)性 AFLP5.寡核苷酸探針 ASO6.單鏈構(gòu)象多態(tài)性 SSCP,每個人的DNA是不完全相同的，一般每100－500bp就有一個是不相同的，即多態(tài)性。在兩套基因組DNA中平

14、均有1000萬處不同，它們多位于內(nèi)含子序列中。堿基的變異就可能導(dǎo)致酶切點的消失或新的切點出現(xiàn)，當(dāng)使用同一限制酶切割不同個體基因組DNA時，DNA片段長度出現(xiàn)差異，這種由于內(nèi)切酶切點變化所導(dǎo)致的DNA片段長度的差異，稱為限制性片段長度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism, RFLP）。 RFLP反映了常見的個體間DNA核苷酸的可遺傳性變異，它按照孟德爾方式遺傳。RFLP可用Sou

15、thern印跡雜交法檢出。,1. RFLP (restriction fragment length polymorphism),,等位基因2由于出現(xiàn)新的切點，DNA片段縮至8kb。,DNA片段電泳后雜交圖,,,,,,,,,RFLP的檢出等位基因1因有額外切點而導(dǎo)致產(chǎn)生兩個長短不同的DNA片段（3kb及5kb）且均能與探針雜交。,在人類基因組中還存在一類DNA重復(fù)序列，稱為小衛(wèi)星DNA。它們分布十分廣泛，每個重復(fù)單位通常只有幾－－幾十

16、個堿基對，但其重復(fù)次數(shù)在人群中是高度變異的，又叫數(shù)目變異的串聯(lián)重復(fù)（variable number tandem repeats,VNTR）。當(dāng)用限制酶切割VNTR區(qū)時，只要酶切點不在重復(fù)區(qū)內(nèi)，就可能得到各種長度不同的片段，可用于致病基因的連鎖分析。,串聯(lián)重復(fù)的短片段的長度多態(tài)性可以通過PCR擴增后電泳來檢出，并用于致病基因的連鎖分析，這種診斷方法稱為擴增片段長度多態(tài)性（AFLP）連鎖分析法。 PCR擴增后，產(chǎn)物即等位片段之間的

17、差別有時只有幾個核苷酸，故需用聚丙烯酰胺凝膠電泳分離鑒定。此法多用于突變性質(zhì)不明的連鎖分析。,2. AFLP（ amplified fragment length polymorphism）,當(dāng)基因的突變部位和性質(zhì)已完全明了時，可以合成等位基因特異的寡核苷酸探針（allele-specific oligonucleotide，ASO）用同位素或非同位素標(biāo)記進行診斷。探針通常為長20bp左右的核苷酸。用于探測點突變時需要合成兩種或兩種以

18、上的探針，一種與正?；蛐蛄型耆恢拢芘c之穩(wěn)定地雜交，但不能與突變基因序列雜交；另一種與突變基因序列一致，能與突變基因序列穩(wěn)定雜交，但不能與正常基因序列穩(wěn)定雜交，這樣，就可以把只有一個堿基發(fā)生了突變的基因區(qū)別開來。,3. ASO（allele-specific oligonucleotide）,PCR可結(jié)合ASO，即PCR－ASO技術(shù)，即先將含有突變點的基因有關(guān)片段進行體外擴增，然后再與ASO探針作點雜交，這樣大大簡化了方法，節(jié)約了

19、時間，而且只要極少量的基因組DNA就可進行。,等位基因特異的寡核苷酸探針(ASO)檢測點突變,4、聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction,PCR）,PCR原理,PCR原理,,,１變性,PCR原理,,,１復(fù)性,,,PCR原理,,,１延伸,,,,,PCR原理,,,２變性,,,,,PCR原理,,,２復(fù)性,,,,,,,,,PCR原理,,,２延伸,,,,,,,,,,,,,PCR原理,,,３變性,,,,,,,,,,,,,

20、PCR原理,,,３復(fù)性,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,PCR原理,,,３延伸,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,,DNA以指數(shù)形式擴增(2n)，其中長片段以線性形式擴增 (2n+2)，最終主產(chǎn)物片段長度在兩個引物之間。,預(yù)變性(92-95?C,2-5m),變性(92-95?C,30s),復(fù)性(40-60?C,30s),延伸(72?C,30-60s),總延伸(72?C,7m),,,,,,(25-35),

21、PCR的一般過程：,經(jīng)過30次的循環(huán), 擴增的DNA片段可達(dá)100萬倍以上。,5、Southern 雜交法,細(xì)胞,基因診斷的臨床檢測應(yīng)用,1. 基因診斷在感染性疾病檢測中的應(yīng)用乙型肝炎病毒（HBV）、人乳頭瘤病毒（HPV）：其DNA可以使用點雜交、PCR方法直接檢出。丙型肝炎病毒（HCV）、人免疫缺陷病毒（HIV）：其RNA可以使用RT-PCR方法直接檢出。結(jié)核桿菌和瘧原蟲的分型可以使用探針雜交和PCR方法檢出。,丙型肝炎(

22、HCV)基因診斷實例,丙型肝炎為RNA病毒，9500mer，編碼3011-3033個氨基酸，具有高變異性。基因組組成：,NCR: 非編碼區(qū),5′- NCR為保守的區(qū)域，將引物設(shè)計在該區(qū)域，進行RT-PCR, 可特異性的擴增HCV。,PCR引物：+: 5’-GATTCTCGAGGCGACACTCCACCATAGAT-: 5’-ATACTCGAGGTGCACGGTCTACGAGACCT,2. 基因診斷在遺傳病檢測中的應(yīng)用 鐮狀

23、細(xì)胞貧血癥（? globin，?6 ），其GAG?GTG的突變，可用RFLP（Mst II，CCTNAGG）或PCR-SSCP檢出。,甲型血友病（FVIII－，XR）可用PCR-RFLP檢出。,,,142 bp 99 bp,3. 基因診斷在腫瘤檢測中的應(yīng)用在許多腫瘤中存在的癌基因 ras、myc等的突變抗癌基因P53、Rb等的突變、丟失可用PCR、PCR-ASO、PCR-SSCP等方法檢出。,4. 基因診斷在個體識別中的

24、應(yīng)用鑒定基因多態(tài)性的方法均可用于：親子鑒定、個體識別、法醫(yī)物證,基因治療（gene therapy）,基因治療的策略,1、生殖細(xì)胞基因治療：生殖細(xì)胞基因治療(germ cell gene therapy)是將正?；蜣D(zhuǎn)移到患者的生殖細(xì)胞（精細(xì)胞、卵細(xì)胞中早期胚胎）使其發(fā)育成正常個體，顯然，這是理想的方法。1、體細(xì)胞基因治療：體細(xì)胞基因治療(somatic cell gene therapy)是指將正?；蜣D(zhuǎn)移到體細(xì)胞，使之表達(dá)基

25、因產(chǎn)物，以達(dá)到治療目的。,基因治療的方法,1．基因轉(zhuǎn)移方法 （1）特異正常基因的分離與克?。?（2）外源基因的轉(zhuǎn)移： 基因轉(zhuǎn)移（gene transfer）是將外源基因?qū)爰?xì)胞內(nèi)。,基因轉(zhuǎn)移方法：,1）化學(xué)法：將正?；駾NA（及其拷貝）與帶電荷物質(zhì)和磷酸鈣、DEAE－葡萄糖或與若干脂類混合，形成沉淀的DNA微細(xì)顆粒，直接傾入培養(yǎng)基中與細(xì)胞接觸，由于鈣離子有促進DNA透過細(xì)胞有作用，某些化合物可擾亂細(xì)胞膜，故可將DNA輸入

26、細(xì)胞內(nèi)，并整合于受體細(xì)胞的基因組中，在適當(dāng)?shù)臈l件下，整合基因得以表達(dá)，細(xì)胞亦可傳代。 方法簡單，但效率極低，一般1000－100000個細(xì)胞中只有一個細(xì)胞可結(jié)合導(dǎo)入的外源基因。,2）物理法：包括電穿孔法和直接顯微注射法,①電穿孔法：電穿孔法（electroporotion）是將細(xì)胞置于高壓脈沖電場中，通過電擊使細(xì)胞產(chǎn)生可逆性的穿孔，周圍基質(zhì)中的DNA可滲進細(xì)胞，但有時也會使細(xì)胞受到嚴(yán)重?fù)p傷。 ②顯微注射法：顯微注射（microi

27、njection）是在顯微鏡直視下，向細(xì)胞核內(nèi)直接注射外源基因，這種方法應(yīng)是有效的。但一次只能注射一個細(xì)胞，工作耗力費時。此法用于生殖細(xì)胞時，有效率可達(dá)10％。直接用于體細(xì)胞卻很困難。,③脂質(zhì)體法：脂質(zhì)體（liposome）法是應(yīng)用人工脂質(zhì)體包裝外源基因，再與靶細(xì)胞融合，或直接注入病灶組織，使之表達(dá)。,3）同源重組法：同源重組（homologous recombination）是將外源基因定位導(dǎo)入受體細(xì)胞的染色體上，在該座位因有同源序列

28、，通過單一或雙交換，新基因片段替換有缺陷的片段，達(dá)到修正缺陷基因的目的。,4）病毒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移：前述的化學(xué)和物理方法都是通過傳染方式基因轉(zhuǎn)移。病毒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移（viral mediated gene transfer）是通過轉(zhuǎn)換方式完成基因轉(zhuǎn)移，即以病毒為載體（vector）,將外源目的基因通過基因重組技術(shù)，將其組裝于病毒上，讓這種重組病毒去感染受體宿主細(xì)胞，這種病毒稱為病毒運載體（viral vector）。,兩種病毒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移方法

29、,①反轉(zhuǎn)錄病毒載體：反轉(zhuǎn)錄病毒雖是RNA病毒，但有反轉(zhuǎn)錄酶，可使RNA轉(zhuǎn)錄為DNA，再整合到宿主細(xì)胞基因組。 ②DNA病毒介導(dǎo)載體（DNA viral mekiated vector）：DNA病毒包括腺病毒、SV40、牛乳頭瘤病毒、皰疹病毒等。,1、靶細(xì)胞,靶細(xì)胞：是指接受轉(zhuǎn)移基因的體細(xì)胞。選擇靶細(xì)胞的原則是：①必須較堅固，足以耐受處理，并易于由人體分離又便于輸回體內(nèi)；②具有增殖優(yōu)勢，生命周期長，能存活幾月至幾年，最后可延續(xù)至病

30、人的整個生命期;③易于受外源遺傳物質(zhì)的轉(zhuǎn)化；④在選用反轉(zhuǎn)錄病毒載體時，目的基因表達(dá)最好具有組織特異性的細(xì)胞。,基因治療存在問題與倫理學(xué),存在著若干重要問題 1．導(dǎo)入基因的穩(wěn)定高效表達(dá)外源基因轉(zhuǎn)移入病人體內(nèi)細(xì)胞表達(dá)，首先與轉(zhuǎn)移方法有關(guān)?；瘜W(xué)和物理方法所導(dǎo)入的基因效率低，自然表達(dá)也差。 2．導(dǎo)入基因的安全性基因治療的安全性應(yīng)確保不因?qū)胪庠茨康幕蚨a(chǎn)生新的有害遺傳變異，這是因為采用反轉(zhuǎn)錄病毒載體而引起的問題。,3．基因治療與社會倫