westernblot(免疫印跡法)

1、WesternBlot(免疫印跡法免疫印跡法)主要包括以下主要包括以下4個(gè)基本步個(gè)基本步驟：?樣品制備?電泳分離?蛋白的膜轉(zhuǎn)移?免疫雜交與顯色――蛋白檢測(cè)溶液和溶液和試劑試劑?1X磷酸鹽緩沖液(PBS)?ModifiedRIPAbufferTrisHCl:50mMpH7.4NP40:1%Nadeoxycholate:0.25%NaCl:150mMEDTA:1mMPMSF:1mMAprotininleupeptinpepstatin:1m

2、icrogrammleachNa3VO4:1mMNaF:1mM?1XSDS樣品緩沖液62.5mMTrisHCl(pH6.8于25C)2%wvSDS10%甘油50mMDTT0.01%wv溴酚藍(lán)?轉(zhuǎn)移緩沖液25mMTrisbase0.2M甘氨酸20%甲醇(pH8.3)?10XTris緩沖鹽(TBS)準(zhǔn)備1L10XTBS:24.2gTrisbase80gNaCl用1NHCl調(diào)pH為7.6?脫脂奶粉或BSA?甲醇?TBST緩沖液1XTBS0.1

3、%Tween20?封閉緩沖液（TBST）1XTBS0.1%Tween20加5%wv脫脂奶粉或BSA?一抗的稀釋1XTBS0.1%Tween20加5%BSA(多抗)或5%脫脂奶粉(單抗)Note:一般來(lái)說(shuō)BSA被推薦用于多克隆抗體，脫脂奶粉用于單克隆抗體，這樣可得到較高的信噪比?？贵w的稀釋度參考抗體說(shuō)明書(shū)或根據(jù)實(shí)驗(yàn)確定。?預(yù)染的蛋白質(zhì)Marker，可用于監(jiān)測(cè)轉(zhuǎn)膜的效率樣品制品制備原始樣品可為細(xì)胞、組織、培養(yǎng)上清、免疫沉淀或親和純化的蛋白，

4、以下為定性檢測(cè)目的蛋白時(shí)細(xì)胞樣品的處理方法，其余的樣品制備方法參閱相關(guān)文獻(xiàn)。2.依據(jù)膠的大小剪取膜和濾紙6片，放入轉(zhuǎn)移緩沖液中平衡10min。如用PVDF膜需用純甲醇浸泡飽和35秒鐘。3.裝配轉(zhuǎn)移三明治：海綿?3層濾紙?膠?膜?3層濾紙?海綿，每層放好后，用試管趕去氣泡。切記：膠放于：膠放于負(fù)極面（黑色面）。極面（黑色面）。4.將轉(zhuǎn)移槽置于冰浴中，放入三明治（黑色面對(duì)黑色面），加轉(zhuǎn)移緩沖液，插上電極，100V，1h（電流約為0.3A）。

5、注意：注意：應(yīng)再次再次檢查檢查三明治和三明治和電極是否裝配極是否裝配正確，正確，電源是否接通。源是否接通。5.轉(zhuǎn)膜結(jié)束后，切斷電源，取出雜交膜white()black()spongespongewhatmanwhatmangelfilter免疫免疫雜交與交與顯色1用25mlTBS洗膜5min，室溫，搖動(dòng)。2置膜于25ml封閉緩沖液中1h室溫，搖動(dòng)。315mlTBST洗3次（5minT）。4加入合適稀釋度的一抗，室溫孵育12h或4C過(guò)夜，

6、緩慢搖動(dòng)。515mlTBST洗3次（5minT）。6加入合適稀釋度的堿性磷酸酶（AP）或辣根過(guò)氧化酶（HRP）標(biāo)記的二抗，室溫孵育1h，緩慢搖動(dòng)。715mlTBST洗3次（5minT）。815mlTBS洗1次。9蛋白檢測(cè)(顯色法或發(fā)光法，按相應(yīng)試劑說(shuō)明操作)。注意事注意事項(xiàng)：1操作中戴手套，不要用手觸膜。2PVDF膜在甲醇中浸泡時(shí)間不要超過(guò)5秒。3如檢測(cè)小于20kD的蛋白應(yīng)用0.2m的膜，并可省略轉(zhuǎn)移時(shí)的平衡步驟。4某些抗原和抗體可被T