嗜水氣單胞菌AH10(CCTCC AB2014155)基因組的比較分析及其耐藥性的研究.pdf

1、致病性嗜水氣單胞菌(Aeromonas hydrophila,Ah)廣泛存在于水產(chǎn)養(yǎng)殖中，致病范圍廣，呈現(xiàn)出世界分布的趨勢(shì)。Ah引起的敗血癥、腸炎、皮膚潰爛等疾病給水產(chǎn)養(yǎng)殖帶來了極大的經(jīng)濟(jì)損失，給我國(guó)乃至世界范圍內(nèi)的養(yǎng)殖戶，帶來極大影響。Ah引起的疾病多采用抗生素進(jìn)行治療，然而在實(shí)際生產(chǎn)中，對(duì)于發(fā)病后的檢測(cè)，目前還沒有一個(gè)比較健全的體制，因此也導(dǎo)致了抗生素濫用嚴(yán)重。由于大量抗生素被應(yīng)用到環(huán)境中去，導(dǎo)致養(yǎng)殖水環(huán)境中抗生素殘留嚴(yán)重，Ah耐藥

2、性逐漸提高，給防治帶來了更大的困難。為探討Ah耐藥性機(jī)制，為實(shí)際生產(chǎn)提供理論基礎(chǔ)，本研究通過誘導(dǎo)Ah耐藥，采用基因組測(cè)序，比對(duì)分析的方法開展了以下工作：
　　(1)為了解Ah全基因組信息的結(jié)構(gòu)和功能，對(duì)AH10進(jìn)行了全基因組測(cè)序。將提取的AH10全基因組DNA進(jìn)行片段化、構(gòu)建文庫后上機(jī)測(cè)序；基因組組裝后注釋和比較分析。結(jié)果顯示：AH10全基因組序列總長(zhǎng)度為4.91Mb，GC含量為61.1％，共預(yù)測(cè)到4570個(gè)基因，3351個(gè)基因具

3、有明確的生物學(xué)功能。共找到2592個(gè)基因具有直系同源族(Cluster of orthologous groups，COG)分類，1281個(gè)與代謝通路有關(guān)的基因，基因組島31個(gè)。比較基因組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)：AH10比對(duì)到SNP位點(diǎn)102481個(gè)，與Aeromonas hydrophila YL17基因結(jié)構(gòu)共線性最好，與美國(guó)來源的Ah標(biāo)準(zhǔn)菌株Aeromonas hydrophila ATCC7966具有較近的親緣關(guān)系，AH10的致病性與溶血素基

4、因hly(Hemolysin gene)、氣溶素基因aer(Aerolysin gene)、黏附素基因ahal(Major adhesion gene)、絲氨酸蛋白酶基因ahp(Serine protease gene)、細(xì)胞興奮性腸毒素基因alt(Cytotonic enterotoxin gene)密切相關(guān)。這些基因在Ah中同源性較高。存在自體誘導(dǎo)物信號(hào)分子-2(Autoinducer-2)與合成信號(hào)分子酶基因(Signal mol

5、ecule synthetase gene ahyI)和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)蛋白基因(transcriptional regular gene AhyR)群體感應(yīng)(Quorum sensing QS)系統(tǒng)，不存在III型分泌系統(tǒng)(type III secretion system TTSS)。
　　(2)從五大類抗生素中各挑選出具有代表性的(一種或兩種)抗生素，在針對(duì)Ah菌株AH10(CCTCC保藏號(hào)：AB2014155)的防耐藥突變濃度(m

6、utant prevention concentration,MPC)的瓊脂平板上，分別篩選出五株耐藥菌株，并對(duì)篩選的耐藥菌株進(jìn)行交叉耐藥性分析，制定出這些耐藥菌株對(duì)常用抗生素的最小抑菌濃度(minimal inhibitory concentrations,MIC)圖譜。結(jié)果顯示:分離的耐藥菌株對(duì)所使用抗生素的MIC均提高100倍以上。4℃劃線平板冰箱保存條件下，一個(gè)月內(nèi)個(gè)別耐藥菌株耐藥性下降。在藥物篩選壓力下，菌株耐藥性隨著傳代次數(shù)

7、增多而表現(xiàn)出遞增的趨勢(shì)。同屬一類抗生素耐藥相關(guān)性較高；不同大類抗生素壓力下篩選出來的耐藥菌株表現(xiàn)出不同的交叉耐藥性。
　　(3)對(duì)強(qiáng)力霉素誘導(dǎo)的5株耐藥菌株進(jìn)行全基因組測(cè)序，并將基因組測(cè)序結(jié)果與原始菌株AH10和9株來自Genebank的Ah基因組信息進(jìn)行比對(duì)，分析其差異性。結(jié)果顯示：在14株菌株序列中，共包含有4730個(gè)基因，其中3056個(gè)核心基因。與原始菌株AH10相比，單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide po

8、lymorphisms,SNP)和插入缺失標(biāo)記(insertion-deletion,INDEL)較少，且這些SNPs和INDELs均不在編碼區(qū)。但是拷貝數(shù)變異(copy number variation,CNV)和結(jié)構(gòu)變異(structure variation,SV)較多。對(duì)其耐藥基因檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：耐藥基因差異多樣性，bl1fox基因僅存在于4AK4中，5株耐藥菌中只有AH104具有tetl基因，此基因在原始菌株AH10中并不存在。