2023年全國(guó)碩士研究生考試考研英語一試題真題(含答案詳解+作文范文)_第1頁(yè)
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1、彈性蛋白酶是一種以降解不溶性彈性蛋白為特征的廣譜水解蛋白酶。其用途廣泛:可作為生化用藥;用于食品及化妝品工業(yè);處理污水等。該酶產(chǎn)品的生產(chǎn)一般由豬胰臟提取,受動(dòng)物臟器資源的限制,彈性蛋白酶價(jià)格昂貴。而微生物生產(chǎn)的彈性蛋白酶具有產(chǎn)率高、生產(chǎn)工藝簡(jiǎn)單,生產(chǎn)條件易于控制等優(yōu)點(diǎn),頗有發(fā)展前途。 1.對(duì)嗜水氣單胞菌產(chǎn)彈性蛋白酶條件進(jìn)行優(yōu)化。單因素法優(yōu)化了氮源、碳源等培養(yǎng)基成分及培養(yǎng)溫度和初始pH值等培養(yǎng)條件,采用三因素三水平的正交試驗(yàn)對(duì)氮源

2、濃度、碳源濃度、鹽離子濃度進(jìn)行優(yōu)化,結(jié)果發(fā)現(xiàn)較低濃度的氮源、碳源有利于酶的產(chǎn)生,表面活性劑能明顯提高酶的產(chǎn)量。嗜水氣單胞菌產(chǎn)彈性蛋白酶的最佳條件:胰蛋白胨5g/L,蔗糖5g/L,NaCl 2.5g/L,K<,2>HPO<,4>2g/L,Tween-80活性劑1g/L,初始pH為7.5,28℃培養(yǎng)48h。 2.用10kDa的截流膜超濾,30-60%的硫酸銨分級(jí)沉淀、凝膠過濾層析和陰離子交換層析,獲得純化的嗜水氣單胞菌胞外彈性蛋白酶

3、,SDS-PAGE電泳顯示,該酶是分子量約為33kDa的單體蛋白。該彈性蛋白酶的最適作用pH8.5,最適作用溫度為37℃,有廣譜的底物降解能力,能降解彈性蛋白、酪蛋白、明膠、牛血清白蛋白,但不能降解角蛋白;EDTA、OPA能抑制酶的活性,PMSF對(duì)酶活沒有影響,表明該蛋白酶屬于Zn<'2+>/Fe<'2+>金屬蛋白酶。 3.用活化的右旋糖酐及單甲氧聚乙二醇(MPEG)分別對(duì)純化的嗜水氣單胞菌彈性蛋白酶進(jìn)行化學(xué)修飾。修飾后的酶與原

4、酶相比,修飾酶保留了天然酶的活性,兩種修飾酶活性均能保留在60%以上,用MPEG修飾酶的保留活性更高(85.5%),而且兩種修飾酶在耐熱性、耐酸性等方面都優(yōu)于天然酶,但修飾酶最佳pH沒變。修飾酶較天然酶穩(wěn)定,具有較高的實(shí)用意義。 4.根據(jù)GenBank嗜水氣單胞菌AG2株彈性蛋白酶基因(AhyB)設(shè)計(jì)一對(duì)含EcoR Ⅰ、Xho Ⅰ雙酶切位點(diǎn)的特異引物,以嗜水氣單胞菌J-1(AhJ-1)株基因組為模板,PCR擴(kuò)增得到一 787bp

5、的基因片斷,將PCR產(chǎn)物與pMD18-T載體連接,測(cè)序,分析發(fā)現(xiàn)與嗜水氣單胞菌AG2彈性蛋白酶(ahyB)基因有92%同源性,與豚鼠氣單胞菌胞外蛋白酶同源性達(dá)95%,與銅綠假單胞菌LasB基因同源性為81%。然后將PCR產(chǎn)物連入表達(dá)載體pET-32a,轉(zhuǎn)化至大腸桿菌BL21菌株中用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá),誘導(dǎo)后出現(xiàn)50kDa的融合表達(dá)產(chǎn)物,產(chǎn)物以包涵體形式出現(xiàn);用His TaqNi<'2+>親和層析柱在變性條件下純化該表達(dá)蛋白;純化蛋白復(fù)

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