紅鰭東方鲀低溫轉(zhuǎn)錄組基因差異表達分析及系譜認證研究.pdf

1、紅鰭東方鲀是我國北方的經(jīng)濟養(yǎng)殖品種，為了提高種質(zhì)質(zhì)量，減少養(yǎng)殖過程中產(chǎn)生的經(jīng)濟損失，實驗從紅鰭東方鲀系譜認證、耐寒基因篩選及低溫相關(guān)調(diào)節(jié)機制開展相關(guān)研究。利用微衛(wèi)星標記技術(shù)、實時熒光定量技術(shù)和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)分析等對紅鰭東方鲀養(yǎng)殖家系進行科學(xué)研究。
　　選取18℃、8℃、5℃脅迫下的肝臟組織進行轉(zhuǎn)錄組測序，通過KEGG數(shù)據(jù)庫對差異基因進行Pathway分析，結(jié)果顯示差異基因主要集中在新陳代謝通路，而且在信號轉(zhuǎn)導(dǎo)、運輸和代謝方面差異基因存

2、在較多。通過GO功能顯著性富集分析，結(jié)果顯示隨著溫度降低，與分子功能有關(guān)的部分消化酶活性均有不同程度的下調(diào)，這在一定程度上對魚類自身機體的代謝強度產(chǎn)生了相關(guān)影響，酶活與調(diào)節(jié)機制代謝，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等有著重要的聯(lián)系作用。在溫度下降的過程中，鐵離子的結(jié)合和血紅素的結(jié)合能力也呈下調(diào)趨勢，這與低溫環(huán)境下魚類的活動減弱有著密不可分的關(guān)系。在低溫脅迫下，魚類活動減弱，呼吸變慢，吸入魚體內(nèi)部的氧氣也隨之減少，整個魚體的溶氧情況對魚體自身也起了一定的調(diào)節(jié)作用

3、，魚體在低溫條件下，大部分的能量作為熱能來平衡體內(nèi)內(nèi)環(huán)境與外界水溫造成的溫度差，鰓呼吸現(xiàn)象減弱，使得水中的氧氣擴散到血液中的機會變少，機體細胞受到一定損傷，細胞膜通透性變大，于是外界離子進入體內(nèi)，使得鐵離子的結(jié)合能力降低。隨著溫度的下降，DNA結(jié)合、RNA結(jié)合、染色質(zhì)結(jié)合、轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合、蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶（protein arginine methyltransferase，PRMTs）及核心啟動子序列結(jié)合相關(guān)的調(diào)控均呈上升趨勢，我

4、們認為這與相關(guān)蛋白功能的調(diào)控有密切關(guān)系，如蛋白質(zhì)精氨酸甲基轉(zhuǎn)移酶已發(fā)現(xiàn)在染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的調(diào)控、蛋白質(zhì)的拼接及組裝、DNA修復(fù)、轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)，信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等多個方面發(fā)揮著重要作用。
　　為了研究紅鰭東方鲀(Takifugu rubripes)相關(guān)耐低溫機制，利用實時熒光定量（qPCR）技術(shù)，分析抗凍蛋白（AFP）、冷誘導(dǎo)RNA結(jié)合蛋白（CIRP）、高速遷移蛋白家族蛋白（HMGB1）、Y-box結(jié)合蛋白在溫度18℃、13℃、8℃，5℃脅迫下，紅鰭

5、東方鲀肝、脾、腎、腦、心、腸、肌肉、性腺，皮中的基因表達的情況。據(jù)結(jié)果可知，4個基因在各個組織中均有表達，AFP基因在各組織中的表達量整體呈現(xiàn)遞增趨勢，在5℃時AFP基因在各組織中的表達量均達到最大，相比對照組表達量差異顯著升高（P＜0.05）；CIRP基因在心、腸，皮的表達量隨溫度降至8℃時達到最大，在5℃時表達量有所降低，其中腸中CRIP基因的表達量在13℃、8℃，5℃時的表達量均顯著高于對照組（P＜0.05），在脾、肌肉，性腺中，

6、 CIRP基因的表達量隨溫度的下降而呈現(xiàn)上升趨勢，并均在5℃時表達量達到最大值與對照組差異顯著（P＜0.05）；HMGB1基因在各個組織中的表達量均呈上升趨勢，并在脾、腎、腦、心、腸，性腺中的表達量均與對照組形成顯著性差異（P＜0.05），且在8℃時表達量達最大值，溫度從8℃降到5℃時，HMGB1在各組織中的表達量呈下降趨勢；Y-box基因在不同溫度下的各個組織中均有表達，在5℃時，Y-box在組織脾，腸，性腺中其表達量明顯高于對照組形

7、成顯著性差異（P＜0.05），在8℃時，Y-box在肌肉中的表達量顯著高于對照組18℃（P＜0.05），13℃時，Y-box基因在脾、腎、腦、腸，性腺中的表達量顯著高于對照組18℃（P＜0.05）。從結(jié)果得知，紅鰭東方鲀AFP1基因和HMGB1基因與溫度存在一定的相關(guān)性，說明AFP1基因和HMGB1基因在紅鰭東方鲀低溫脅迫下機體對冷刺激的調(diào)節(jié)發(fā)揮著重要的作用，CIRP基因和Y-box基因雖有不同程度的表達，但未發(fā)現(xiàn)明顯變化規(guī)律，可能與基

8、因?qū)Φ蜏孛{迫下作出的應(yīng)答機制較為復(fù)雜有密切的關(guān)系。
　　本研究從2015年所建的12個紅鰭東方鲀家系中隨機選取5個家系，針對5個紅鰭東方鲀家系，利用8個微衛(wèi)星標記對其遺傳多樣性進行分析和系譜認證。8個位點共檢測得到32個等位基因。每個位點等位基因范圍從3到6，平均值為4。平均觀測雜合度范圍從0.4533到0.9533，平均期望雜合度范圍從0.4908到0.7901，平均多態(tài)信息含量范圍從0.4555到0.7546。不同位點共發(fā)現(xiàn)8

9、個家系特異性等位基因，7＃家系發(fā)現(xiàn)3個，3＃和11＃家系各發(fā)現(xiàn)2個，12＃家系發(fā)現(xiàn)1個，10＃家系未發(fā)現(xiàn)特異性等位基因。根據(jù)子代基因型成功推斷出5個家系的親本基因型，據(jù)此鑒別各個家系。在fms15位點，可將3＃和11＃家系與其他家系相區(qū)別；TOG01位點可將7＃家系與其他家系相區(qū)別；f1497位點可將12＃家系相區(qū)別。因此，fms15，TOG01，f1497這三對標記可以作為鑒別5個家系的特異性標記。結(jié)果說明，所選的8個微衛(wèi)星標記在這5

10、個家系中多態(tài)信息含量較高，且在已選用的8個微衛(wèi)星標記中，最少用3個微衛(wèi)星標記可鑒別5個紅鰭東方鲀家系。運用相同方法，我們采用7對微衛(wèi)星引物對暗紋東方鲀遺傳多樣性進行分析和系譜認證。7個位點共檢測得到29個等位基因。每個位點等位基因范圍從3到6，平均值為4.1。平均觀測雜合度范圍從0.4917到0.9583，平均期望雜合度范圍從0.5270到0.7691,平均多態(tài)信息含量范圍從0.4669到0.7272。不同位點共發(fā)現(xiàn)3個家系特異性等位基