紅鰭東方鲀組織蛋白酶B、L的異源表達(dá)及粗酶液性質(zhì)研究.pdf

1、消費(fèi)者在食用魚(yú)類時(shí)，主要食用部位是肌肉，而肝臟等一般會(huì)被丟棄，造成浪費(fèi)及污染，但是有些魚(yú)類，例如河豚，被公認(rèn)最鮮美的部位恰好是肝臟。紅鰭東方鲀味道鮮美，已從其體內(nèi)發(fā)掘了系列鮮味肽，但其形成機(jī)制尚未明確。組織蛋白酶B、L可通過(guò)降解肌原纖維蛋白及肌鈣蛋白發(fā)揮著重要的滋味形成作用。為了探索其對(duì)紅鰭東方鲀呈味肽的形成機(jī)制，本文以紅鰭東方鲀?yōu)檠芯繉?duì)象，利用分子生物學(xué)技術(shù)，成功得到組織蛋白酶B和L粗酶液，為今后研究紅鰭東方鲀蛋白質(zhì)的降解機(jī)制奠定基礎(chǔ)

2、，具體研究?jī)?nèi)容和結(jié)果如下：
　　（1）通過(guò)查找NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)分析序列得到全長(zhǎng)分別為1482 bp與1336 bp的紅鰭東方鲀組織蛋白酶B、L的序列，從組織蛋白酶B、L的序列中設(shè)計(jì)引物，同時(shí)從紅鰭東方鲀肌肉中提取RNA并轉(zhuǎn)錄為cDNA作為模板克隆，通過(guò)驗(yàn)證得到與目的基因大小相一致的條帶。同時(shí)通過(guò)測(cè)序證明所克隆得到的是源自紅鰭東方鲀組織蛋白酶B、L的序列。
　　（2）選擇pET-28a(+)作為表達(dá)載體分別構(gòu)建組織蛋白酶B、L的

3、表達(dá)系統(tǒng)，以E.coli BL21作為重組工程菌進(jìn)行表達(dá)，成功得到大小約為36KDa的重組組織蛋白酶B、L，驗(yàn)證了其可在大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)中成功克隆表達(dá)。本文為進(jìn)一步研究紅鰭東方鲀組織蛋白酶B與組織蛋白酶L的酶學(xué)特性及其對(duì)滋味形成奠定了基礎(chǔ)。
　　（3）通過(guò)比較不同的蛋白酶純化方式，將得到的重組組織蛋白酶B、L粗酶液進(jìn)行純化，可知硫酸銨沉淀法可以初步去除雜蛋白。然后分別用Z-Arg-Arg-AMC、Z-Phe-Arg-AMC作為組織