輸血科常用實驗及工作體會

1、輸血科常用實驗及工作體會,山東省立醫(yī)院輸血科 王 玉 芝,前 言,血型鑒定、交叉配血、抗體篩選試驗是輸血科目前最常用的試驗，也是每個輸血工作者應(yīng)該熟練掌握的試驗，根據(jù)工作經(jīng)驗我們認為在試驗過程中一些細節(jié)容易被忽略，值得注意，現(xiàn)將工作中的一些體會與大家一起探討交流，請大家提出寶貴意見。,ABO血型鑒定,1、鑒定原理：根據(jù)紅細胞上有無A抗原或(和)B抗原及血清中有無相應(yīng)抗體將血型

2、分為A型、B型、AB型和O型四種 正定型（細胞定型） 反定型（血清定型）2、方法：試管法、微柱凝膠法、玻片法均為凝集試驗,ABO血型鑒定（試管法）,1、試驗材料：正定試劑：抗-A、抗-B（是否質(zhì)控？質(zhì)控要求？記錄？）抗-AB 確認弱A、B抗原，與弱A、B抗原親 和力強,會產(chǎn)生較強反應(yīng)?？?H 用于檢查亞型及孟買型?？?A1 用于A亞型檢測。,ABO血型鑒定（試管法）,反定試劑A1細胞（為什么

3、？）、B細胞，自制細胞的質(zhì)控 O細胞 檢查是否存在ABO系統(tǒng)以外抗體干擾ABO反定型。自身對照 用于確認正反定型結(jié)果的有 效性,排除自身抗體對定型的干擾(如冷凝集等)。A2細胞 用于A亞型的鑒定（有些A亞型產(chǎn)生抗-A1抗體而不產(chǎn)生抗A2）。,ABO血型鑒定（試管法）,2、試驗方法：正定：1滴2~5%被檢者紅細胞+1~2滴標準血清混勻，3400 轉(zhuǎn)15秒（轉(zhuǎn)速的選擇）反定：2滴受檢者血清+1滴標準紅細胞混勻離心,ABO血

4、型鑒定（試管法）,3、結(jié)果判定：搖動力度，細胞扣邊緣情況，弱凝集的判斷（亞型尤其重要）正定預(yù)期結(jié)果3+~4+，如果出現(xiàn)弱凝集應(yīng)該考慮是抗原減弱還是亞型，不能輕易錯過。血型判定并記錄正反不一致的思考與解決？關(guān)鍵在于認識發(fā)現(xiàn)問題,ABO血型鑒定（試管法）,4、正反不一致的原因分析實驗人員技術(shù)操作錯誤紅細胞標本的相關(guān)問題血清標本的相關(guān)問題,ABO血型鑒定（試管法）,技術(shù)操作錯誤試劑濃度與配比，一般問題不大，但是比例不合適可能

5、漏檢亞型忘記加試劑，試劑工作中有可能出現(xiàn)結(jié)果判定，尤其對溶血結(jié)果的認識，如果是血清標本可能遇到，56度破壞補體驗證記錄錯誤，實際工作中對于錯誤報告占很大比例標本錯誤,ABO血型鑒定（試管法）,紅細胞問題：ABO亞型！使正定凝集較弱，也是發(fā)現(xiàn)亞型的關(guān)鍵所在白血病或其它惡性疾病使患者紅細胞的A、B抗原減弱?。』颊呓谳斎肓薃BO不同型紅細胞，或ABO不同型的骨髓移植，可能出現(xiàn)混合視野。紅細胞獲得性或遺傳性異常，如獲得性B抗原

6、、T/Tn多凝集紅細胞。某些疾?。ㄈ绺骨话?dǎo)致血漿中存在大量的型物質(zhì)，中和抗-A或抗-B抗體，引起正定型為假陰性或弱陽性。患者血清中的高效價自身冷凝集素使紅細胞發(fā)生凝集?。?ABO血型鑒定（試管法）,血清標本相關(guān)問題新生兒抗體陰性或很弱、老年人抗體減弱?。“籽?、淋巴瘤及使用免疫抑制劑的患者、先天丙種球蛋白缺乏的患者、免疫缺陷的患者抗體減弱！！ABO不同型骨髓移植患者。使用血漿或凝固不完全的血清會形成很小的纖維蛋白凝集的紅

7、細胞凝塊??！患者血清中有不規(guī)則抗體或自身冷凝集素??！某些疾?。ǘ喟l(fā)性骨髓瘤、巨球蛋白血癥、何杰金淋巴瘤等）導(dǎo)致球蛋白水平增高，引起緡錢狀凝集；纖維蛋白原水平增高，會引起緡錢狀凝集；血漿增容劑（葡聚糖、PVP）也會引起緡錢狀凝集導(dǎo)致假陽性結(jié)果。,ABO血型鑒定（試管法）,5、正反不符處理程序：患者的年齡患者的病史患者的近期輸血史患者的近期用藥史患者是否進行了骨髓移植患者以前的血型家系調(diào)查處理細胞、血清、改變試驗條件增加

8、試驗（洗滌細胞、改變比例、反應(yīng)溫度、吸收放散、血型物質(zhì)測定）,ABO血型鑒定（試管法）,常見問題解決ABO亞型正定：抗-A、抗-B、抗-AB、抗-A1、抗-H反定：A1c、A2c、Bc、Oc、自身對照吸收放散唾液型物質(zhì)檢測有條件者可作家系調(diào)查,ABO血型鑒定（試管法）,A、B抗原減弱延長孵育時間、4℃孵育酶處理紅細胞吸收放散唾液型物質(zhì)檢測既往血型調(diào)查,ABO血型鑒定（試管法）,抗體減弱延長孵育時間、4℃孵育加大

9、血清用量（很實用)既往血型調(diào)查酶處理試劑紅細胞,ABO血型鑒定（試管法）,冷自身抗體將血清和紅細胞分別在37孵育后再混合用37℃溫鹽水洗滌紅細胞、45℃熱放散3分鐘巰基試劑(DTT)處理紅細胞自身吸收去除血清中的自身冷抗體,ABO血型鑒定（試管法）,室溫反應(yīng)的同種抗體用譜細胞做抗體鑒定選擇沒有相應(yīng)抗原的A、B細胞做反定型,ABO血型鑒定（微柱法）,1、原理：是生物化學(xué)凝膠過濾技術(shù)和免疫學(xué)抗原抗體反應(yīng)相結(jié)合的產(chǎn)物，通過調(diào)節(jié)

10、凝膠的濃度來控制凝膠間隙的大小。使其間隙只能允許游離的R BC通過，從而使游離RBC與聚集RBC分離。如果通過離心RBC沉積在凝膠管底部，則表明RBC未發(fā)生凝聚凝集，是陰性反應(yīng)， 若RBC聚集在凝膠帶上部，則表明RBC發(fā)生凝集，呈陽性反應(yīng)。其本質(zhì)仍是凝集試驗（凝膠可能不同，長春為葡聚糖。）基本概念：特異性膠、中性膠、抗人球蛋白試劑膠,ABO血型鑒定（微柱法）,2、試驗材料：比較單一，都是商品化，定量加樣，注意細胞濃度0.8%3、操

11、作：正定 反定（加樣順序）4、結(jié)果判定：按說明，凝集強度判斷，注意混合視野的判定，弱凝集的判定5、注意事項：細胞濃度，試劑一定室溫平衡，最好室溫反應(yīng)15分鐘再離心以增強弱反強度（衛(wèi)生部2008第1批質(zhì)控出現(xiàn)的問題，有2個標本反定正確率60%）,ABO血型鑒定（微柱法）,6、假陽性反應(yīng)可見于：（1）未完全除去纖維蛋白原的不完全血清標本，殘存纖維蛋白原在凝膠中成為纖維蛋白，阻礙紅細胞沉淀而浮于膠中或膠表面。（我們收到衛(wèi)生部2、3批質(zhì)

12、控標本有此現(xiàn)象） （２）被檢標本染菌也使紅細胞浮于膠中或膠表面。（3）被檢紅細胞破碎，常管底及近底部一側(cè)，而不是在管底尖部。此為離心時微柱管離心力方向和該微管軸向方向不一致，本應(yīng)為陰性結(jié)果的沉淀位置偏離而呈似弱陽性是因為紅細胞陳舊，此時即使應(yīng)該是陰性結(jié)果，但破碎紅細胞膜沉于膠中或膠面呈弱陽性。（4）實驗室溫度低時，因凝膠顆粒活動性減少，單個細胞穿過時困難，容易出現(xiàn)假陽性結(jié)果。,ABO血型鑒定（微柱法）,（5）鐮刀形紅細胞貧血病

13、人在做血型配血時易出現(xiàn)假陽性：正常的紅細胞有一定的變形性，可以通過小于其直徑的凝膠間隙，而鐮形紅細胞貧血的病人紅細胞變形能力降低，剛性增大，不能透 過凝膠間隙，故出現(xiàn)假陽性。（6）嚴重感染的病人易出現(xiàn)假陽性： 病人血清或血漿中的白細胞過多，堵塞了凝膠間隙，從而影響了紅細胞的沉降，造成假陽性。（曾遇到一例）,ABO血型鑒定（微柱法）,7、假陰性反應(yīng)：（1）抗體過少、弱。（2）抗原、抗體比例不合適。注意：不是一個實驗方法可以檢測

14、出所有抗原抗體反應(yīng)。,ABO血型鑒定,總結(jié)注意弱反應(yīng)（尤其是正定，一般應(yīng)該很強）發(fā)現(xiàn)正反不一致，不能輕易錯過，慎用假陽性解釋，可重復(fù)試驗有問題的做好記錄，解決方案，不斷總結(jié)不同試驗方法結(jié)合，試管與微柱各有優(yōu)缺點發(fā)現(xiàn)問題是關(guān)鍵，由于每個醫(yī)院情況不同，大部分醫(yī)院試劑不全，不能準確判斷其亞型，但是應(yīng)該具備發(fā)現(xiàn)亞型的能力.,RH血型鑒定,1、原理：根據(jù)是否具有D抗原區(qū)分Rh陰陽性2、試劑：IgM;IgG+IgM3、操作及結(jié)果解釋

15、試劑選擇及陰性確認問題！！試劑選擇：輸血科可以選擇IgM試劑Rh陰性確認：輸血科與血站對陰性標本的處理不同，輸血科對陰性標本不必再進一步確認，以防弱D或部分D患者輸入Rh陽性血；血站必須對RH陰性標本確認，以防弱D過部分D血液輸給Rh陰性患者。,交叉配血,常用方法 鹽水：發(fā)現(xiàn)IgM抗體 凝聚胺、微柱凝膠、酶法：發(fā)現(xiàn)IgG型不規(guī) 則抗體,交叉配血（凝聚胺）,原理：（略）操作：（是否質(zhì)控？記錄？）試劑用量:假凝集消

16、除液不能輕易多加，可能會造成假陰性反應(yīng)時間：加凝聚胺試劑后不可立即離心，應(yīng)使其充分反應(yīng)觀察時間：一分鐘之內(nèi)觀察結(jié)果影響因素：抗凝劑的影響（反定凝集較差可能受到抗凝劑影響，可以多加凝聚胺試劑凝集較好）、細胞濃度不可太濃,交叉配血（微柱凝膠）,原理：屬于經(jīng)典的抗人球蛋白試驗操作：50微升0.8%紅細胞+25微升血清或血漿（根據(jù)廠家說明）結(jié)果判斷：不能錯過弱凝集，如果有懷疑可以重復(fù)試驗，注意：標本最好抗凝、離心以消除纖維蛋白帶來的

17、干擾,交叉配血（微柱凝膠）,凝聚胺與微柱凝膠法兩種方法的差異：微柱法相對敏感，但不是萬能的，有些抗體可能凝聚胺更敏感（如Rh抗體），實際工作很難發(fā)現(xiàn)此現(xiàn)象，可能與工作人員的熟練程度有關(guān)，不管任何一種方法配血不合均不能發(fā)血。,抗體篩選（微柱法）,操作及結(jié)果判斷（略）抗體篩選陽性結(jié)果的處理：最好作抗體鑒定，有些稀有抗體配血成功率極低可以尋求幫助，一般醫(yī)院可能無此條件用微柱法和凝聚胺兩種方法同時配血或者用微柱凝膠法配血，絕對不可以單純用

18、凝聚胺配血（方法的差異可能漏檢）,問題討論：1、微柱法抗體篩選弱陽性，遇配血不合標本是否也應(yīng)為弱陽性？（劑量效應(yīng)以及紅細胞的新鮮度的影響）2、微柱法抗體篩選陽性，選擇3袋微柱法配血均相合是否說明抗體篩選為假陽性？3、微柱法抗體篩選陽性，是否可用凝聚胺法直接配血選擇相合血液？,發(fā)現(xiàn)B(A)血型1例,試管法正定AB，A抗原弱于B抗原，但是結(jié)果明顯微柱法正反定型，正反定型相符為B型，抗A抗體很強與正?？笰無差異，懷疑初檢血型錯誤試管

19、法正反定型復(fù)檢：正定AB，反定B型，懷疑特殊血型或標本問題保險起見重抽標本，結(jié)果相同懷疑A亞型B，產(chǎn)生抗A（以上試驗我科完成）省血液中心送檢，報告A2B,發(fā)現(xiàn)B(A)血型1例,我科隨后進行以下試驗：父母血型鑒定：父親：O 母親：與女兒血型表現(xiàn)一致，初步判為 cisAB根據(jù)資料一般cisAB為A強B弱，產(chǎn)生抗B，而此例A弱B強產(chǎn)生抗A，與B(A)血型表現(xiàn)一致，高度懷疑B(A)無法確認，送上海血液中心進行血清血及分子生物學(xué)

20、確認,上海血液中心鑒定結(jié)果,ABO正定抗-A 抗B 抗A1 人源抗A 人源抗B 2+ 4+W - 1+ 4+W說明確實存在A、B抗原ABO反定：A1細胞 B細胞 O細胞 A2細胞（6滴） 3+S - - 1+W說明確實存在抗-A，且與A1

21、、A2細胞同時凝集抗-H： O細胞 B細胞 患者細胞 2+S 1+W 2+說明 抗H增強,上海血液中心鑒定結(jié)果,結(jié)論：患者存在AB抗原，且A弱B強；血清中存在抗A，同時和A1、A2細胞凝集；抗-H增強，符合B(A)特點鑒定為：B（A）血型為了進一步證實進行基因測序結(jié)論為640堿基變異，A被G取代為B（A）*04型,B(A)血型血清學(xué)特點,B(A)血

22、型血清學(xué)特點：同時存在AB抗原，A弱B強一般鑒定為A亞型B，但是存在抗A同時和A1A2細胞凝集，和一般A亞型B不同，一般A亞型B產(chǎn)生抗A1，僅和A1細胞凝集，且H抗原相對與B不增強，因A亞型B有正常的B抗原分子生物學(xué)特點：PCR方法具有B基因和O基因，為遺傳學(xué)的B型；基因測序B基因基礎(chǔ)上發(fā)生堿基突變，使其具有部分A基因特性，因此也產(chǎn)生A抗原。目前總共發(fā)現(xiàn)5個B（A）血型，04、05均為上海血液中心05年發(fā)現(xiàn)，其基因序列被收錄入Gen