動(dòng)物細(xì)胞工程--第四章-動(dòng)物干細(xì)胞

1、第四章 動(dòng)物干細(xì)胞,第一節(jié) 干細(xì)胞的概念和分類(lèi)一、概念,干細(xì)胞（Stem cell）是一類(lèi)具有自我更新和分化潛能的細(xì)胞,能產(chǎn)生表型和基因型與自己完全相同的子細(xì)胞，并具有不同分化潛能。,胚胎干細(xì)胞,形態(tài)特征：圓形或橢圓形，體積小，核質(zhì)比大；生化特征：較高的端粒酶活性；一般都有獨(dú)特的表 面標(biāo)志；增殖特征: 自穩(wěn)定性：?jiǎn)渭?xì)胞或無(wú)脊椎動(dòng)物——不對(duì)稱(chēng)分裂 哺乳動(dòng)物—

2、—種群意義上的不對(duì)稱(chēng)分裂分化特征：是干細(xì)胞最重要的特征。干細(xì)胞本生不 是終末分化細(xì)胞，具有再分化的潛力。,干細(xì)胞的主要生理特征：,,,二、分類(lèi)一）根據(jù)發(fā)生來(lái)源分類(lèi)胚胎干細(xì)胞：成體干細(xì)胞：,來(lái)自早期胚胎（ESC）、原始生殖細(xì)胞（PGC）、或畸胎瘤組織（EC）等,如骨髓造血干細(xì)胞（HSC），間質(zhì)干細(xì)胞（MSC），神經(jīng)干細(xì)胞（NSC）,ESC,什么是畸胎瘤,如果在胚胎不同時(shí)期，某些多能細(xì)胞從整體上分離或脫落

3、下來(lái)，使細(xì)胞基因發(fā)生突變，分化異常，則可發(fā)生胚胎異常。一般認(rèn)為，這種分離或脫落發(fā)生于胚胎早 期，則形成畸胎；而如發(fā)生于胚胎后期，則形成了具有內(nèi)胚層、中胚層和外胚層三個(gè)胚層的異常分化組織，即形成了畸胎瘤。,,鼻咽畸胎瘤,淋巴管瘤,生殖嵴與PGC（原始生殖細(xì)胞）,,成體干細(xì)胞：神經(jīng)干細(xì)胞,,,二）根據(jù)分化潛能分類(lèi)全能干細(xì)胞：如ESC多能干細(xì)胞：如造血干細(xì)胞、間充質(zhì)干細(xì)胞定向祖細(xì)胞：如造血母細(xì)胞等。專(zhuān)能干細(xì)胞：皮膚干細(xì)胞，成

4、肌細(xì)胞等,,三）根據(jù)干細(xì)胞存在的組織器官分類(lèi)胚胎干細(xì)胞造血干細(xì)胞神經(jīng)干細(xì)胞肝臟干細(xì)胞皮膚干細(xì)胞肌肉干細(xì)胞等,第二節(jié) 胚胎干細(xì)胞,通過(guò)建立體外培養(yǎng)的方法，獲得保持增殖且不分化的胚胎干細(xì)胞系的技術(shù)稱(chēng)為胚胎干細(xì)胞的建系。一、胚胎來(lái)源的干細(xì)胞系（p132 圖6-1）1. 囊胚階段的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)（ICM）2. 來(lái)源于生殖嵴部位的原始生殖細(xì)胞（PGC）3. 來(lái)源于畸胎瘤組織（EC）,二、胚胎干細(xì)胞的建系,主要步驟包括：1. 培養(yǎng)體

5、系的選擇和準(zhǔn)備2. 胚胎采集3. ICM的獲取4. ICM的離散5. ESC的建系,1. 培養(yǎng)體系的選擇和準(zhǔn)備,飼養(yǎng)層細(xì)胞的準(zhǔn)備：飼養(yǎng)層細(xì)胞一方面對(duì)ESC細(xì)胞帖壁起支持作用，另一方面其分泌蛋白可抑制ESC分化，維持其增殖特性和多能性。常用飼養(yǎng)層細(xì)胞為成纖維細(xì)胞（如STO成纖維細(xì)胞系）、子宮內(nèi)皮細(xì)胞、3T3細(xì)胞株等。為了阻斷飼養(yǎng)層細(xì)胞的分裂，而不影響其分泌蛋白的產(chǎn)生，通常采用γ射線(xiàn)或絲裂霉素C處理之。,,培養(yǎng)基的準(zhǔn)備：用D

6、MEM（高糖）培養(yǎng)液，其中胎牛血清的濃度和質(zhì)量很重要，還要加非必須氨基酸；β-巰基乙醇。常采用添加LIF等抑制ESC的分化潛能；添加EGF等生長(zhǎng)因子來(lái)促進(jìn)ESC的增殖。,LIF抑止胚胎干細(xì)胞分化的信號(hào)通路,LIF 干細(xì)胞表面的LIF受體和gp130蛋白形成異二聚體 激活JAK酪氨酸激酶系統(tǒng)

7、 激活MAP激酶ERK級(jí)聯(lián)反應(yīng)和STAT3蛋白 STAT3形成同型二聚體入核 激活核內(nèi)靶基因轉(zhuǎn)錄 表達(dá)相應(yīng)蛋白抑止ESC的分化,,,,,,,2. 胚胎的采集一般囊胚期胚胎或后桑葚胚

8、。3. ICM的獲取1）直接分離法：囊胚于飼養(yǎng)層上自行發(fā)育成孵化囊胚，待ICM擴(kuò)大增殖時(shí)挑取?；蚴褂面溍沟鞍酌柑幚鞿P，獲得裸胚培養(yǎng)。2）免疫分離法：鏈霉蛋白酶去除囊胚晚期胚泡ZP，依次轉(zhuǎn)移至補(bǔ)體滅活和未滅活的抗血清中，去除滋胚層細(xì)胞后，吸取ICM，移至飼養(yǎng)層培養(yǎng)。,4. ICM的離散胰蛋白酶消化即可離散ICM。5. 胚胎干細(xì)胞建系,三、胚胎干細(xì)胞的應(yīng)用,,第三節(jié)、胚胎干細(xì)胞的生物學(xué)特性與鑒定方法,一、生物學(xué)特性增殖與分化

9、特征：永生化(immortal)；能維持穩(wěn)定的正常的二倍體染色體結(jié)構(gòu)；有穩(wěn)定的發(fā)育潛能，能被誘導(dǎo)增殖或分化；能參與胎兒所有組織的發(fā)育過(guò)程；,形態(tài)特征體積小、核大，有一個(gè)或多個(gè)核仁；胚胎干細(xì)胞克隆緊密堆積，細(xì)胞之間無(wú)明顯的界限，細(xì)胞克隆有一定形狀規(guī)律。生化特征具有堿性磷酸酶和端粒酶活性；表達(dá)SSEA-3、SSEA-4、TRA-1-60等表面標(biāo)志；表達(dá)OCT-4蛋白；,,Otc4基因,Otc4基因被認(rèn)為在整個(gè)卵子生成和囊

10、胚附殖前以及早期外胚層中都表達(dá)，是受精卵全能性的關(guān)鍵。Otc4基因只能在胚胎中才能得到完全表達(dá)，而在成體動(dòng)物體細(xì)胞中的表達(dá)基本上被關(guān)閉。這就意味著克隆人技術(shù)的第一步就存在很大問(wèn)題。所以O(shè)tc4也被稱(chēng)為克隆人終結(jié)者。,二、胚胎干細(xì)胞的鑒定方法,1. 形態(tài)鑒定：核質(zhì)比大，體積小，細(xì)胞集落小鼠呈鳥(niǎo)巢狀，牛、豬等呈饅頭狀，人呈扁平、松散聚合體。2. 核型分析：二倍體核型，染色體受損情況等。,3. ESC特異性表面抗原表達(dá)的鑒定：小鼠

11、ESC以SSEA-1為主，人以SSEA-3、SSEA-4為主。此外，ALP、Otc-4等都可作為表面標(biāo)志。4. 端粒酶活性鑒定：端粒長(zhǎng)度及端粒酶活性檢測(cè)。5. 體內(nèi)外分化能力鑒定：體內(nèi)外分化能力鑒定,改變細(xì)胞的培養(yǎng)條件: 改變細(xì)胞的培養(yǎng)條件是ES細(xì)胞定向分化的基本策略,常用的方法有:與輔助細(xì)胞共培養(yǎng);在半固體培養(yǎng)基中原位生長(zhǎng)分化;添加生長(zhǎng)因子、化學(xué)誘導(dǎo)劑等。導(dǎo)入外源性基因,使其分化為某一特定類(lèi)型的細(xì)胞。

12、體內(nèi)定向分化,使ES 細(xì)胞多數(shù)分化為該組織特異性的細(xì)胞。,三、胚胎干細(xì)胞定向誘導(dǎo)分化的方法,胚胎干細(xì)胞的誘導(dǎo)分化： 胎牛血清，骨髓基質(zhì)細(xì)胞共培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞－－－－－－－－－－－－－－－?造血細(xì)胞 　RA胚胎干細(xì)胞－－－－－－－－－－－－－－－?神經(jīng)細(xì)胞 DMSO胚胎干細(xì)胞－－－－－－－－－－－－－－－?肌肉細(xì)胞

13、 TGF-B1, VEGF, bFGF胚胎干細(xì)胞－－－－－－－－－－－－－－－?血管和內(nèi)皮細(xì)胞 RA+胰島素+T3胚胎干細(xì)胞－－－－－－－－－－－－－－－?脂肪細(xì)胞 BMP-2, BMP-4胚胎干細(xì)胞－－－－－－－－－－－－－－－?軟骨細(xì)胞 　地塞米松，磷酸甘油胚胎干細(xì)胞－－－－－－－－－－－－－－－?骨細(xì)胞

14、 基因轉(zhuǎn)染胚胎干細(xì)胞－－－－－－－－－－－－－－－?胰島素分泌細(xì)胞,人胚胎干細(xì)胞注射至免疫缺陷小鼠的后腿肌肉中形成的各種組織：（a）腸樣結(jié)構(gòu)；(b)神經(jīng)上皮花結(jié)；(c）骨骼；(d)軟骨 ；(e)橫紋肌；(f)腎。,A.小鼠成纖維飼養(yǎng)細(xì)胞上培養(yǎng)8天后的ICM（標(biāo)尺＝100um）B.ICM中分離出的H9細(xì)胞系（標(biāo)尺＝100um）C. H9細(xì)胞系（標(biāo)尺＝50um）D.在無(wú)小鼠胚胎成纖維細(xì)胞，但

15、有LIF（20ng/ml）的條件下培養(yǎng)5d后，H9細(xì)胞發(fā)生分化（標(biāo)尺＝100um）,第四節(jié)、成體干細(xì)胞,一、概念和生物學(xué)特征概念： 指一群分布在成體組織中尚未分化的、具有自我更新、并負(fù)有構(gòu)建和補(bǔ)充某種組織的各種類(lèi)型細(xì)胞潛能的干細(xì)胞。生物學(xué)特征：1、慢周期性2、自我更新和再生能力的有限性3、不對(duì)稱(chēng)分裂4、細(xì)胞鑒定標(biāo)志,二、成體干細(xì)胞的分離與鑒定（以HSC為例）無(wú)菌采集骨髓 低滲處理 密度梯度離

16、 心 獲單核細(xì)胞 CD34抗體標(biāo)記 流式細(xì)胞儀分離結(jié)合免疫吸附分離 鑒定。,,,,,,,如造血干細(xì)胞的鑒定：,細(xì)胞形態(tài) ：集落呈非貼壁生長(zhǎng)，細(xì)胞形態(tài)較小細(xì)胞表面標(biāo)志：flk-1（Fetal Liver Kinase 1); L/TAL-1； CD34；GATA-1；基因表達(dá)：TAL-1；GATA-2 ；βH1；β主要珠蛋白 體外

17、移植：漿細(xì)胞移植給患者能恢復(fù)造血功能，并且二次移植仍可重建造血系統(tǒng)。,三、成體干細(xì)胞的應(yīng)用：細(xì)胞移植技術(shù),細(xì)胞類(lèi)型 治療的疾病神經(jīng)細(xì)胞 　　 中風(fēng)、帕金森氏病、老年癡呆癥、 脊髓損傷、多發(fā)性硬化病心肌細(xì)胞 心臟病發(fā)作、充血性心臟病產(chǎn)生胰島素的

18、細(xì)胞 糖尿病軟骨細(xì)胞 骨性關(guān)節(jié)炎血細(xì)胞 癌癥、免疫缺乏癥、遺傳學(xué)血液 病、白血病肝細(xì)胞肝炎、肝硬化皮膚細(xì)胞燒傷骨細(xì)胞骨質(zhì)疏松癥視網(wǎng)(眼)細(xì)胞黃斑癥骨骼肌細(xì)胞 肌肉萎縮癥,作

19、業(yè)題,1、什么是干細(xì)胞？如何分類(lèi)？2、干細(xì)胞有什么生物學(xué)特性？3、簡(jiǎn)述來(lái)源于ICM的胚胎干細(xì)胞分離方法。4、ESC培養(yǎng)時(shí)常用的飼養(yǎng)層細(xì)胞有哪些？其作用是是什么？5、什么是成體干細(xì)胞？有哪些種類(lèi)？,補(bǔ)充知識(shí)：組織工程,１.組織工程的概念　　應(yīng)用工程學(xué)和生命科學(xué)的原理和方法，研究細(xì)胞、組織誘導(dǎo)因子和生物材料間相互作用的關(guān)系，研制生物性替代物用以修復(fù)或重建組織器官的結(jié)構(gòu)，維持、恢復(fù)和改善病損組織或器官的功能。,,1993年Lange

20、r及Vacanti兩位學(xué)者在著名的”Science”學(xué)術(shù)期刊上提出組織工程(tissue engineering)的構(gòu)想，隨後根據(jù)此構(gòu)想將軟骨細(xì)胞培養(yǎng)於人耳形狀的生醫(yī)材料上，再植入老鼠背部(上圖)，形成具有耳朵外觀(guān)的組織，此一前瞻性技術(shù)成為組織工程研究的先驅(qū)。,2.組織工程的方法,活體組織細(xì)胞分離 與胞外基質(zhì)分子混合 細(xì)胞體外培養(yǎng)擴(kuò)增形成組織

21、 移植到體內(nèi),,,,３.組織工程的三要素細(xì)胞、支架、信號(hào),（1）種子細(xì)胞,細(xì)胞必須能不斷進(jìn)行細(xì)胞分裂，且必須能被調(diào)控分化成特定的組織細(xì)胞 干細(xì)胞：胚胎干細(xì)胞、成體干細(xì)胞(如MSC) 組織來(lái)源細(xì)胞：自體或異體組織細(xì)胞,Growth factor stimulation,（2）組織生長(zhǎng)支架需求：,,符合生物安全性要求合適的可生物降解吸收性合適的孔尺寸、高孔隙率和相連的孔形態(tài)特定的三維外形高表面積和合

22、適的表面理化性質(zhì)與植入部位組織力學(xué)性能相匹配的結(jié)構(gòu)強(qiáng)度,組織工程支架的來(lái)源,支架材料天然高分子材料合成降解聚合物生物陶瓷生物復(fù)合材料,不同形態(tài)結(jié)構(gòu)的組織工程生物材料,天然高分子材料,蛋白質(zhì)支架膠原明膠多糖支架海藻酸鹽殼聚糖透明質(zhì)酸蛋白質(zhì)－多糖支架,合成聚合物材料,聚丙烯酸及其衍生物聚乙二醇及其共聚物 聚乙烯醇聚交酯聚乳酸（PLA）聚（D,L-乳酸-co-乙醇酸）（PLGA）聚乙交酯（PGA）等,支架設(shè)

23、計(jì)及制備技術(shù),生物陶瓷,磷酸鈣陶瓷聚磷酸鈣羥基磷灰石珊瑚（碳酸鈣）,支架設(shè)計(jì)及制備技術(shù),成骨細(xì)胞良好地粘附于殼聚糖 - 明膠 / 羥基磷灰石支架上，生長(zhǎng)狀態(tài)良好，分泌大量細(xì)胞外基質(zhì)。,（3）生長(zhǎng)因子,表皮生長(zhǎng)因子：是對(duì)上皮細(xì)胞增殖有很強(qiáng)促進(jìn)作用的53個(gè)氨基酸殘基的多肽。神經(jīng)生長(zhǎng)因子：為神經(jīng)細(xì)胞特異性分泌的營(yíng)養(yǎng)蛋白。肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子：為728個(gè)氨基酸殘基單鏈組成。骨形態(tài)發(fā)生蛋白：能誘導(dǎo)或刺激新骨的生成。,4.技術(shù)路線(xiàn),體外得到工