動物細(xì)胞工程制藥

1、第 三 章動物細(xì)胞制藥,第一節(jié) 概 述,細(xì)胞學(xué)說的建立組織培養(yǎng)和細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞工程學(xué),第二節(jié) 動物細(xì)胞的形態(tài)和生理特點(diǎn),一、動物細(xì)胞的形態(tài) 適應(yīng)功能,形態(tài)各異。 離體培養(yǎng)細(xì)胞分兩類： 貼壁細(xì)胞 懸浮細(xì)胞,⒈貼壁細(xì)胞 生長須有貼附的支持物表面，自身分泌或培養(yǎng)基中提供的貼附因子才能在該表面上生長。 兩種形態(tài)： 成纖維細(xì)胞型 上皮細(xì)胞型,⒉懸浮細(xì)胞

2、 生長不依賴支持物表面，在培養(yǎng)液中呈懸浮狀態(tài)生長。如淋巴細(xì)胞。⒊兼性貼壁細(xì)胞 生長不嚴(yán)格依賴支持物。如中國地鼠卵巢細(xì)胞，小鼠L929細(xì)胞。,二、動物細(xì)胞的化學(xué)組成和代謝,1.動物細(xì)胞的化學(xué)組成2.動物細(xì)胞的代謝,三、動物細(xì)胞的生理特點(diǎn),⒈ 細(xì)胞的分裂周期長 細(xì)胞分裂時間為12～48h， 細(xì)胞的分裂 周期=間期+分裂期 間期（G1+S+G2） 分裂期（M）,G1期：4～6h 合成DNA聚合酶

3、 RNA合成S期：6～8h DNA合成G2期：2～5h DNA量加倍, RNA合成M期：0.5～1h 染色體分裂,細(xì)胞代數(shù)為細(xì)胞分裂次數(shù)傳代數(shù)表示細(xì)胞培養(yǎng)分種傳代次數(shù) 細(xì)胞代數(shù)=傳代數(shù)×分種數(shù)/2 X=(logN-logNo)÷log2 X 代數(shù) N 培養(yǎng)最終細(xì)胞數(shù) No 培養(yǎng)起始細(xì)胞數(shù)

4、 倍增時間=培養(yǎng)經(jīng)過時間÷代數(shù),⒉細(xì)胞生長需貼附于基質(zhì),并有接觸抑制現(xiàn)象。⒊正常二倍體細(xì)胞的生長壽命是有限的。 原代培養(yǎng) 有限細(xì)胞系 無限細(xì)胞系,⒋動物細(xì)胞對周圍環(huán)境十分敏感. 各種理化因素：滲透壓、pH、離子濃度、剪切 力、微量元素等。,⒌動物細(xì)胞對培養(yǎng)基要求高 必需氨基酸、維生素、無機(jī)鹽、微量元素、葡萄糖、細(xì)胞生長因子、貼壁因子等。,⒍動物細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成途徑和修飾功能與細(xì)菌不同。

5、 動物細(xì)胞蛋白質(zhì)的合成部位： 游離核糖體：合成蛋白質(zhì)用于細(xì)胞質(zhì)基質(zhì)內(nèi)。 粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的核糖體：合成蛋白質(zhì)是分泌的和膜中的整合蛋白多為糖蛋白。,動物細(xì)胞生產(chǎn)藥物缺點(diǎn):培養(yǎng)條件高、成本貴、產(chǎn)量低。優(yōu)點(diǎn):分泌胞外、純化方便、翻譯 后修飾糖基化，與天然產(chǎn)品一致。,第三節(jié) 生產(chǎn)用動物細(xì)胞的要求和獲得,一、生產(chǎn)用動物細(xì)胞的要求 原代細(xì)胞 二倍體細(xì)胞系 轉(zhuǎn)化細(xì)胞系,二、生產(chǎn)用動物細(xì)胞的獲

6、得,⒈原代細(xì)胞 是直接取自動物組織器官,經(jīng)過粉碎消化而獲得的細(xì)胞懸液（109/g）。 需要大量動物，費(fèi)錢費(fèi)勞力。 雞胚細(xì)胞、原代兔腎細(xì)胞、鼠腎細(xì)胞、淋巴細(xì)胞。,⒉二倍體細(xì)胞系　 原代細(xì)胞經(jīng)過傳代篩選克隆，從多種細(xì)胞成分的組織中，挑選并純化出某種具有一定特征的細(xì)胞株。,二倍體細(xì)胞有正常細(xì)胞的特點(diǎn)：①染色體組型是2n核型；②貼壁依賴接觸抑制；③可傳代培養(yǎng)50代；④無致瘤性。,二倍體細(xì)胞,⒊轉(zhuǎn)

7、化細(xì)胞系 通過某個轉(zhuǎn)化過程形成的，常由于染色體斷裂變成異倍體，失去正常細(xì)胞特點(diǎn)，而獲得無限增殖能力。轉(zhuǎn)化過程可以是自發(fā)的，和人工的，從腫瘤組織中。,4.融合細(xì)胞系(1)仙臺病毒融合法(2)聚乙二醇融合法(3)電融合法5.重組工程細(xì)胞系,三、基因工程細(xì)胞構(gòu)建和篩選,在生產(chǎn)中采用更多的更有前景的是融合細(xì)胞及采用基因工程構(gòu)建的各種工程細(xì)胞。,被用構(gòu)建工程細(xì)胞的動物細(xì)胞有： CHO-dhfr 、BHK-21、 Namalw

8、a、Vero、 SP2/0、 Sf-9 等細(xì)胞。,⒈真核細(xì)胞基因表達(dá)載體的構(gòu)建 使用的載體有兩類：㈠病毒載體 牛痘病毒、腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、桿狀病毒㈡質(zhì)粒載體,㈠病毒載體,牛痘病毒： 用構(gòu)建多價疫苗 腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒： 用于基因治療。 桿狀病毒： 用于外源基因表達(dá)。,其作為載體的 優(yōu)點(diǎn)： ①雙鏈DNA，易重組 ②插入7～8kb DNA不影響正常病毒粒子的形成。 ③多角體

9、蛋白和病毒粒子的形成無直接關(guān)系，因此用外源基因更換多角體蛋白基因，仍能形成有感染力病毒粒子；,④多角體蛋白基因有非常強(qiáng)的啟動子，產(chǎn)生的蛋白質(zhì)可占全部蛋白質(zhì)的20%～30%；⑤用光學(xué)顯微鏡可看到多角體，可以此作為標(biāo)記物，選陽性克隆。⑥如用家蠶桿狀病毒，還可在蠶體表達(dá)外源基因。,質(zhì)粒載體 在細(xì)菌和哺乳動物細(xì)胞體內(nèi)都能擴(kuò)增，都含有如下基本成分： ①允許載體在細(xì)菌體內(nèi)擴(kuò)增的質(zhì)粒序列。 ②含有使基因表達(dá)的調(diào)控元件。 ③

10、能用以篩選出外源基因已整合的選擇標(biāo)記。 ④有時還帶有選擇性增加拷貝數(shù)的擴(kuò)增系統(tǒng)。,⒉基因載體的導(dǎo)入和高效表達(dá)工程細(xì)胞株的篩選,基因載體導(dǎo)動物細(xì)胞常用方法是： 磷酸鈣沉淀法 電穿孔法,磷酸鈣沉淀法： 溶解的DNA 加Na2HPO4和CaCl2 形成磷酸鈣沉淀， DNA被包在磷酸鈣沉淀中，形成DNA—磷酸鈣共沉淀物，當(dāng)和細(xì)胞表面接觸時，則通過細(xì)胞吞噬作用而將DNA導(dǎo)入。,電穿孔法： 借助電

11、穿孔儀的高壓脈沖電場，使細(xì)胞膜出現(xiàn)瞬時可逆性小孔，外源DNA沿小孔進(jìn)入細(xì)胞。轉(zhuǎn)化率較高，拷貝數(shù)低。,BHK-21: 從5只無性別的生長1天的地鼠幼鼠腎臟中分離的;成纖維樣細(xì)胞,核型為2n=44;培養(yǎng)基為DMEM加7%胎牛血清。用于增殖病毒，包括多瘤病毒、口蹄疫病毒、狂犬病毒等并制作疫苗，現(xiàn)已用于工程細(xì)胞構(gòu)建。,四、常用生產(chǎn)用動物細(xì)胞的特性,CHO-K1：從中國地鼠卵巢中分 離的上皮樣細(xì)胞。 核型： 2n=20～22。

12、 培養(yǎng)基：DEME培養(yǎng)基 0.1mmol/L次黃嘌呤，0.1mmol/L胸苷， 10%小牛血清， 加入脯氨酸。,MRC-5： 從正常男性肺組織中獲得的人二倍體細(xì)胞系。 核型為2n=46。 屬成纖維細(xì)胞。 培養(yǎng)基用加小牛血清。 同工酶G6PD B型。,有限壽命42～46代。增殖速度較W1-38快，對不良環(huán)境敏感性較W1-38低。對人的病毒敏感。用于生產(chǎn)疫苗。,Namalw

13、a： 從肯尼亞患有淋巴瘤病人獲取，建成的人的類淋巴母細(xì)胞。2.8%的高倍體率，12～14條標(biāo)記染色體。單條X，無Y。培養(yǎng)基為RPMI 1640，添加7%胎牛血清。用于生產(chǎn)α干擾素。,Sf-9： 1983年從親代IPLB—SF21AE中克隆形成。親代細(xì)胞從秋粘蟲的蛹卵組織中分離獲得。它對苜宿尺蠖核型多角體病毒和其它桿狀病毒高度敏感。,通常用的培養(yǎng)基為Grace培養(yǎng)基，添加3.3g/L 水解乳蛋白和3.3g/L酵母浸液, 10%胎牛血清

14、。用于高效表達(dá)外來蛋白制品。,Vero： 從正常成年非洲綠猴腎臟分離的。 為貼壁依賴的成纖維細(xì)胞，核型2n=60；,培養(yǎng)基為199培養(yǎng)基，加5%胎牛血清；用于增殖病毒，包括多瘤病毒、脊髓灰質(zhì)炎、狂犬病毒。,W1-38：正常胚肺組織人二倍體細(xì)胞系。 核型為2n=46。成纖維細(xì)胞，能產(chǎn)生膠原，培養(yǎng)基用BME（Eagle’ Basal medium）,10%小牛血清，pH7.2,同工酶為G6PD B型。倍增時間為24h，

15、有限壽命50代。安全，用于制備疫苗。,SP2/0-Ag14：通過融合的方法，從有羊抗紅細(xì)胞活性的BALB/c 小鼠的脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞系P3X63Ag8融合雜交瘤SP2/NL-Ag 亞克隆中分離獲得，,能耐受8氮鳥嘌呤 20μg/ml但在含HAT 選擇培養(yǎng)基中不能存活。通常用培養(yǎng)基為DMEM，添加10%胎牛血清。用于生產(chǎn)單抗雜交瘤細(xì)胞和抗體。,五、細(xì)胞庫的建立 生產(chǎn)用的工程細(xì)胞必須建立兩個細(xì)胞庫： ⒈原始細(xì)胞庫 ⒉生產(chǎn)用

16、細(xì)胞庫,⒈原始細(xì)胞庫 貯存時須有該細(xì)胞的詳細(xì)擋案，包括： ①該細(xì)胞系的歷史 ②該細(xì)胞系的特性 ③對各種有害因子的檢查結(jié)果,⒉生產(chǎn)用細(xì)胞庫 從原始細(xì)胞庫來的，或從單一安瓶來，或從多個安瓶來即刻混合，經(jīng)培養(yǎng)擴(kuò)增再分裝儲存形成細(xì)胞庫。,需建擋案，進(jìn)行無菌性無細(xì)胞交叉污染的檢查。需確定最高使用的傳代數(shù)。,第六節(jié) 動物細(xì)胞大量培養(yǎng)的方法和操作方式,一、動物細(xì)胞大量培養(yǎng)的方法,優(yōu)點(diǎn):操作簡單；培養(yǎng)條件比較均一；傳質(zhì)和

17、傳氧較好等。缺點(diǎn)：難采用灌流培養(yǎng)。,,2.貼壁培養(yǎng)優(yōu)點(diǎn)：容易采用灌流培養(yǎng)。缺點(diǎn)：操作麻煩；需要合適的貼壁材料和足夠的面積；培養(yǎng)條件不易均一；傳質(zhì)和傳氧較差等。,3.貼壁-懸浮培養(yǎng)（假懸浮培養(yǎng)）（1）微載體培養(yǎng)60-250um的顆粒，創(chuàng)造大面積供細(xì)胞貼附生長 載體體積小，比重輕，在輕度攪拌下即可攜帶細(xì)胞懸浮于培養(yǎng)基 20世紀(jì)80年代正式用于工業(yè)化生產(chǎn)各種疫苗和細(xì)胞產(chǎn)品,理想的微載體具備的條件：微載體表面性質(zhì)與細(xì)胞有良好的相容

18、性，適于細(xì)胞附著、伸展和增殖；微載體的材料無毒性；微載體的材料是惰性的；微載體的比重為1.030-1.045g/ml；直徑在60-250μm，大小均一；具有良好的光學(xué)透明性；基質(zhì)的性質(zhì)最好是軟性的；可耐120℃高溫，便于滅菌；經(jīng)簡單的適當(dāng)處理后，可反復(fù)使用；原料充分，制作簡便，廉價。,第一代微載體：固體微載體第二代微載體：多孔微載體多孔微載體分類：加鈦；不加鈦,（2）包埋和微囊培養(yǎng)載體材料分類：①人工合成的高分子聚合物；②糖類

19、；③蛋白質(zhì)。,包埋或微囊培養(yǎng)優(yōu)點(diǎn)： ①保護(hù)細(xì)胞，避免了剪切力的損害；②可以獲得較高的細(xì)胞密度；③有利于下游產(chǎn)物的純化；④可以采用多種生物反應(yīng)器進(jìn)行大規(guī)模培養(yǎng)。,（3）結(jié)團(tuán)培養(yǎng)原理：細(xì)胞本身作為基質(zhì)，相互貼附后，再用懸浮培養(yǎng)的方法進(jìn)行培養(yǎng)。,（4）.多空載體培養(yǎng)法 近年發(fā)展的大規(guī)模高密度的培養(yǎng)方法 多空載體是一種支撐材料，內(nèi)部有網(wǎng)狀小孔，細(xì)胞可以在里面生長 即可用于懸浮細(xì)胞的固定化連續(xù)灌流培養(yǎng)，又可用于細(xì)胞的貼壁培養(yǎng)，細(xì)胞生長于

20、內(nèi)部，可免受攪拌等機(jī)械損傷 常用：陶瓷，明膠，纖維素及衍生物，聚苯乙烯等材料,（5）.中空纖維培養(yǎng)法 模擬體內(nèi)的三維培養(yǎng)狀態(tài)，細(xì)胞接種在中空纖維的外腔，利用中空纖維模擬人工毛細(xì)血管供給營養(yǎng)，使細(xì)胞高密度生長 材料有硅膠，聚砜，聚丙烯等，為半透膜,二 動物細(xì)胞培養(yǎng)的操作方式,第七節(jié) 動物細(xì)胞生物反應(yīng)器,理想的動物細(xì)胞生物反應(yīng)器具備的基本要求：①制造生物反應(yīng)器所用的所有材料必須無毒；②具有良好的傳質(zhì)、傳熱和混合的性能；③密封性能良好

21、；。。。。。。,最早于1984年由英國科學(xué)家Spier發(fā)明。 將細(xì)菌發(fā)酵罐進(jìn)行改進(jìn)。該裝置的主要特點(diǎn)是可以避免在向培養(yǎng)基中通氣時氣泡直接損傷細(xì)胞。 同時在采用微載體系統(tǒng)培養(yǎng)時，微載體不會被由于通氣所產(chǎn)生的泡沫滯留在氣液界面中。,籠式通氣攪拌器的改進(jìn)-- NBS裝置作為對最初設(shè)計的籠式通氣攪拌器的改進(jìn)，NBS裝置中分別包括籠式的通氣腔和消泡腔。,氣液交換在由200目不銹鋼絲網(wǎng)制成的通氣腔內(nèi)實(shí)現(xiàn)；而在鼓泡通氣過程中所產(chǎn)生的泡沫經(jīng)管道

22、進(jìn)入液面上部的由200目不銹鋼絲網(wǎng)制成的籠式消泡腔內(nèi)，泡沫經(jīng)鋼絲網(wǎng)破碎分成氣、液兩部分，達(dá)到深層通氣而不產(chǎn)生泡沫的目的。,模擬體內(nèi)的三維培養(yǎng)狀態(tài)，細(xì)胞接種在中空纖維的外腔，利用中空纖維模擬人工毛細(xì)血管供給營養(yǎng)，使細(xì)胞高密度生長 材料有硅膠，聚砜，聚丙烯等，為半透膜,二 動物細(xì)胞生物反應(yīng)器的檢測系統(tǒng),1.培養(yǎng)過程需檢測的物化參數(shù)溫度、pH、攪拌速度、溶氧等2.主要參數(shù)的檢測和控制方法（1）溫度（2）pH（3）溶氧：原理；增加溶

23、氧的措施（4）攪拌（5）進(jìn)出液流量：注意事項(xiàng),第八節(jié) 動物細(xì)胞產(chǎn)品的純化方法和質(zhì)量控制,一、常用的純化方法1.離心2.離子交換層析3.凝膠過濾4.親和層析5.鹽析和有機(jī)溶劑沉淀6.透析7.高壓液相層析,,二、動物細(xì)胞產(chǎn)品的質(zhì)量要求1.對工程細(xì)胞的要求2.對生產(chǎn)工藝的要求3.對產(chǎn)品的質(zhì)量要求：純度；生物活性；比活性；蛋白質(zhì)性質(zhì)鑒定；雜質(zhì)檢測；穩(wěn)定性；臨床前的安全性和有效性評價；臨床試驗(yàn)的安全性和有效性評價。,第九節(jié)