微生物的實驗室培養(yǎng)

1、課題1　微生物的實驗室培養(yǎng),課程標準進行微生物的分離和培養(yǎng)。課標解讀1.知道培養(yǎng)基的基礎(chǔ)知識，進行無菌技術(shù)的操作。2.進行微生物培養(yǎng)。,1．培養(yǎng)基(1)培養(yǎng)基概念按照微生物對 的不同需求，配制出供其 的營養(yǎng)基質(zhì)。,培養(yǎng)基的成分及無菌操作技術(shù),營養(yǎng)物質(zhì),生長繁殖,(2)培養(yǎng)基種類包括 培養(yǎng)基和 培養(yǎng)基等。(3

2、)培養(yǎng)基的化學(xué)成分一般都含有 、 、 和 四類營養(yǎng)成分。還需要滿足微生物生長對 、 及 等的要求。,固體,液體,水,碳源,氮源,無機鹽,pH,特殊營養(yǎng)物質(zhì),氧氣,2．無菌技術(shù)(1)無菌技術(shù)圍繞著如何避免雜菌的污染展開，主要包括以下四個方面①對實驗操作的

3、 、操作者的 ，進行清潔和 ；②將用于微生物培養(yǎng)的器皿、 和 等進行 ；③為避免周圍環(huán)境中微生物的污染，實驗操作應(yīng)在 附近進行；④實驗操作時應(yīng)避免已經(jīng)滅菌處理的材料用具與 相接觸。,空間,衣著和手,消毒,接種用具,培養(yǎng)基,滅菌,酒精燈火焰,周圍的物品,(2)消毒和滅菌①

4、消毒：消毒是指使用 方法僅殺死物體表面或內(nèi)部一部分 的微生物， (包括；不包括)芽孢和孢子，常用的方法有 消毒法、 消毒法、 消毒法。②滅菌：滅菌是指使用 殺死物體內(nèi)外 ，

5、 (包括，不包括)芽孢和孢子，常用的方法有 滅菌、 ＿＿＿滅菌和 滅菌。,較為溫和的物理或化學(xué),對人體有害,不包括,煮沸,巴氏,化學(xué)藥劑,強烈的理化因素,所有的,微生物,包括,灼燒,高壓蒸汽,干熱,[思維激活1] 用酒精擦拭實驗者手臂屬消毒還是滅菌？70%與95%的酒精，哪一種效果更好？為什么？提示　酒精擦拭屬化學(xué)消毒，酒精消毒時，70%的酒精殺

6、菌效果最好。原因是：濃度過高，使菌體表面蛋白質(zhì)凝固成一層保護膜，乙醇分子不能滲入其中；濃度過低，殺菌力減弱。,1．碳源、氮源及生長因子的來源與功能歸納,2.培養(yǎng)基類型劃分,3.無菌技術(shù)(1)消毒和滅菌的區(qū)別,(2)無菌技術(shù)主要操作要求①實驗前應(yīng)對操作空間、操作人員消毒，對所用器具和培養(yǎng)基滅菌。②實驗進行時需在酒精燈火焰周圍無菌區(qū)操作，另外要避免已滅菌處理材料再次污染。,特別提示　(1)微生物最常用的碳源是糖類，尤其是葡萄糖；最常利

7、用的氮源是銨鹽、硝酸鹽。(2)對異養(yǎng)微生物來說，含C、H、O、N的有機物既是碳源，又是氮源、能源。(3)大凡對生長因子不能合成或合成能力有限的微生物，其培養(yǎng)基中均需額外添加生長因子，而許多微生物能自行合成生長因子，其培養(yǎng)基中不需再添加。,【鞏固1】 下列培養(yǎng)基配方中能作為選擇培養(yǎng)基、鑒別培養(yǎng)基的依次是(　　)。,A.①③ B．②① C．②④ D．③①解

8、析　高濃度的食鹽可以抑制多種細菌的生長，但不影響金黃色葡萄球菌的生長，從而可以將金黃色葡萄球菌分離出來，有高濃度食鹽的培養(yǎng)基為選擇培養(yǎng)基。在培養(yǎng)基中加入伊紅和美藍，可以用來鑒別飲用水和乳制品中是否存在大腸桿菌，有伊紅和美藍的培養(yǎng)基為鑒別培養(yǎng)基。答案　D,1．制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基(1)制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基的步驟： →稱量→ → →倒平板。(2)倒平板的過程：

9、①在火焰旁右手拿錐形瓶，左手 。②右手拿錐形瓶，使錐形瓶的瓶口迅速通過 。③左手將培養(yǎng)皿打開一條縫隙，右手將培養(yǎng)基倒入培養(yǎng)皿，左手立刻 。④待平板冷卻凝固后，將平板 放置，使皿蓋在下、皿底在上。,培養(yǎng)基的制備與大腸桿菌的純化技術(shù),計算,溶化,滅菌,拔出棉塞,火焰,蓋上皿蓋,倒過來,2．純化大腸桿菌(

10、1)微生物接種的最常用方法是 和 。(2)平板劃線法：通過 在瓊脂固體培養(yǎng)基表面 的操作，將聚集的菌種 。(3)稀釋涂布平板法：將菌液進行一系列的 ，然后將

11、不同稀釋度的菌液分別 ，進行培養(yǎng)。當稀釋倍數(shù)足夠高時，即可獲得 。,平板劃線法,稀釋涂布平板法,接種環(huán),連續(xù),劃線,逐步稀釋分散到培養(yǎng)基的表面,梯度稀釋,涂布到瓊脂固體培養(yǎng)基的表面,單個細菌形成的菌落,3．菌種的保存為了保持菌種的純凈，需對菌種進行保藏。

12、對于頻繁使用的菌種，我們可以采用 法；對于需要長期保存的菌種，可以采用 法。,臨時保藏,甘油管藏,[思維激活2] 除平板劃線法與稀釋涂布平板法外，還有哪些接種方法？微生物接種技術(shù)中最核心的內(nèi)容是什么？提示　微生物接種方法還有斜面接種及穿刺接種等方法，所有微生物接種方法中最核心的內(nèi)容是“防止雜菌污染，保證培養(yǎng)物的純度”。,1．制備牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基計算：依

13、據(jù)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基配方比例，計算配制100 mL的培養(yǎng)基時，各種成分的用量 稱量：牛肉膏比較黏稠，可用稱量紙稱取，牛肉膏和蛋白胨都易吸潮，稱取時動作要迅速，稱后要及時蓋上瓶蓋,2．微生物分離與純化技術(shù)(1)原理微生物的分離與純化就是將待檢測微生物樣品通過劃線或涂布接種在固體培養(yǎng)基上，樣品中的每一個細胞或孢子都可以生長繁殖形成單個菌落。將單個菌落接種到斜面培養(yǎng)基上，經(jīng)培養(yǎng)后，即可得到一個微生物的純種。,(2)方

14、法步驟微生物的分離包括樣品稀釋、劃線或涂布及培養(yǎng)三個步驟①梯度稀釋操作(如圖1)圖1　微生物分離操作流程圖,a．將分別盛有9 mL水的6支試管滅菌，并按101～106的順序編號。b．用移液管吸取1 mL已培養(yǎng)的菌懸液，注入第二支試管中。用手指輕壓移液管上的橡皮頭，吹吸三次，使菌懸液與水充分混勻。c．從101倍稀釋的試管中吸取1 mL稀釋液，注入102倍稀釋的試管中，重復(fù)第2步的操作。以此類推，直到完成最后一支試管的

15、稀釋。注意：移液管需要經(jīng)過滅菌。操作時，試管口和移液管應(yīng)在離火焰1～2 cm處。,②劃線或涂布平板劃線分離法：在近火焰處，左手拿皿底，右手拿接種環(huán)，挑取大腸桿菌培養(yǎng)液在平板上劃線，常用的劃線方法有平行劃線和連續(xù)劃線兩種。平行劃線時，每轉(zhuǎn)一個角度燒一次接種環(huán)。劃線完畢后，蓋上培養(yǎng)皿蓋，做好標記。圖2　劃線示意圖,涂布分離法：取3個平板，底面分別用記號筆寫上10－4、10－5和10－6三種稀釋度，然后用無菌吸管分別吸取相應(yīng)稀

16、釋度的稀釋液各0.1 mL，放入已標記好的平板上，用無菌玻璃涂棒在培養(yǎng)基表面輕輕地涂布均勻，室溫下靜置5～10 min，使菌懸液吸附進培養(yǎng)基(圖3)。③培養(yǎng)將劃線或涂布接種的平板倒置于培養(yǎng)箱或溫室中37 ℃培養(yǎng)16～24 h，即可長出單菌落(圖4),圖3　涂布法示意圖　　　圖4　斜面接種法,(3)結(jié)果分析①確認培養(yǎng)基制備是否合格為確認培養(yǎng)基制備是否合格，需設(shè)置對照實驗，即接種后的培養(yǎng)基和一個未接種的培養(yǎng)基都放入37 ℃恒溫箱中，

17、培養(yǎng)12 h和24 h，觀察現(xiàn)象并記錄——如果未接種的培養(yǎng)基在恒溫箱中保溫1～2 d后無菌落生長，說明培養(yǎng)基的制備是成功的，否則實驗失敗需要重新制備。,②接種操作成功的標準如果培養(yǎng)基上生長的菌落的顏色、形狀、大小基本一致，并符合該菌菌落的特點，則說明接種操作是符合要求的；如果培養(yǎng)基上出現(xiàn)了其他菌落，則說明接種過程中無菌操作還未達到要求，實驗失敗，需要分析原因，再次制備。,特別提醒　(1)進行劃線時最后一區(qū)和第一區(qū)不可接觸。(2)平板

18、劃線各次灼燒接種環(huán)的目的。平板劃線操作第一次劃線及每次劃線之前都需灼燒滅菌，劃線操作結(jié)束仍需灼燒接種環(huán)，每次灼燒目的不同。(3)灼燒接種環(huán)之后，要冷卻后才能伸入菌液，以免溫度太高殺死菌種。,【鞏固2】 下列有關(guān)平板劃線操作的敘述不正確的是(　　)。A．第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物B．每次劃線前，灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線結(jié)束后，接種環(huán)上殘留的菌種C．在第二區(qū)域內(nèi)劃線時，接種環(huán)

19、上的菌種直接來源于菌液D．劃線結(jié)束后，灼燒接種環(huán)，能及時殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細菌污染環(huán)境和感染操作者,解析　平板劃線操作中，接種環(huán)取菌種前灼燒的目的是避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物，以后每次劃線前灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線后殘留的菌種。劃線結(jié)束仍需灼燒接種環(huán)，是為了能及時殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細菌污染環(huán)境和感染操作者。從第二次劃線開始，每次劃線時接種環(huán)上的菌種直接來源于上次劃線的末端。答案　C,【例1】 氯

20、苯化合物是重要的有機化工原料，因其不易降解，會污染環(huán)境。某研究小組依照下列實驗方案(圖1)篩選出能高效降解氯苯的微生物SP1菌。培養(yǎng)基配方如表1。,微生物的營養(yǎng)與培養(yǎng)基類型,圖1,表1　培養(yǎng)基的組成,(1)配制Ⅱ號固體培養(yǎng)基時，除添加Ⅱ號液體培養(yǎng)基成分外，還應(yīng)添加1%的______。(2)培養(yǎng)基配制時，滅菌與調(diào)pH的先后順序是______。(3)從用途上來說，Ⅰ號培養(yǎng)基和Ⅱ號培養(yǎng)基分別屬于______培養(yǎng)基和______培養(yǎng)基。在Ⅱ

21、號培養(yǎng)基中，為SP1菌提供氮源的成分是______。(4)在營養(yǎng)缺乏或環(huán)境惡劣時，SP1的菌體變成一個圓形的休眠體，這種休眠體被稱為______。,(5)將SP1菌接種在含不同濃度氯苯的Ⅲ號培養(yǎng)液中培養(yǎng)，得到生長曲線(如圖2)。從圖2可知，SP1菌在______培養(yǎng)條件下最早停止生長，其原因是_________________________________。圖2,思維導(dǎo)圖：,深度剖析　本題考查培養(yǎng)基的配制原則以及微生物的

22、實驗室培養(yǎng)過程，意在考查考生的圖表信息轉(zhuǎn)換與分析能力。(1)固體培養(yǎng)基中需加入瓊脂作為凝固劑。(2)先配制培養(yǎng)基后滅菌，調(diào)pH屬于培養(yǎng)基的配制過程，故先調(diào)pH后滅菌。(3)從用途上看，Ⅰ號培養(yǎng)基為通用培養(yǎng)基(基本培養(yǎng)基)；Ⅱ號培養(yǎng)基是選擇培養(yǎng)基，以氯苯為唯一的碳源，其中為SP1菌提供氮源的成分是硝酸銨。(4)芽孢是在細胞質(zhì)內(nèi)高度濃縮脫水形成的抗逆性很強的球形或橢圓形的休眠體。(5)由圖示可知SP1菌在20 mg/L氯苯培養(yǎng)條件下最早停止

23、生長，20 mg/L氯苯可提供的碳源較少，碳源最早耗盡，影響菌體的生長繁殖。,答案　(1)瓊脂　(2)先調(diào)pH，后滅菌　(3)通用　選擇　硝酸銨　(4)芽孢　(5)20 mg/L氯苯　碳源最早耗盡[誤區(qū)警示](1)瓊脂是最常用的凝固劑，但固體培養(yǎng)基未必均加瓊脂，如棉子殼培養(yǎng)基也屬固體培養(yǎng)基。(2)牛肉膏、蛋白胨等天然物質(zhì)既可提供碳源，也可提供氮源及生長因子。,【例2】 培養(yǎng)基、培養(yǎng)皿、接種環(huán)、實驗操作者的雙手、空氣、牛奶所采用的滅菌

24、、消毒方法依次是(　　)。①化學(xué)消毒　②灼燒滅菌?、鄹蔁釡缇、茏贤饩€滅菌?、莞邏赫羝麥缇、薨褪舷痉ˋ．⑤③②①④⑥ B．①②③④⑤⑥C．⑥②③④①⑤ D．③④②①⑥⑤,無菌操作技術(shù),思維導(dǎo)圖：,深度剖析　培養(yǎng)基用高壓蒸汽滅菌；培養(yǎng)皿能耐高溫，需用干熱滅菌；接種環(huán)可用灼燒滅菌達到迅速徹底的滅菌效果；實驗操作者的雙手可用化學(xué)藥劑進行消毒，如用酒精擦拭雙手；空氣可用紫外線消毒；牛奶為不破壞其營養(yǎng)成分可采用巴

25、氏消毒法。答案　A,[思維深化]幾種常用滅菌方法比較(見下表),【例3】 如圖是微生物平板劃線示意圖，劃線的順序為12345。下列操作方法正確的是(　　)。A．操作前要將接種環(huán)放在火焰邊灼燒滅菌B．劃線操作須在火焰上進行C．在5區(qū)域中才可以得到所需菌落D．在12345區(qū)域中劃線前后都要對接種環(huán)滅菌,微生物純化培養(yǎng),深度剖析　本題考查平板劃線的操作方法。在每次劃線前后都要對接種環(huán)進行滅菌，接種環(huán)的滅菌方法應(yīng)是

26、在火焰上灼燒，接種時劃線操作是在火焰邊進行。在5個區(qū)域中，只要有單個活細菌，通過培養(yǎng)即可獲得所需菌落。答案　D,[歸納提升](1)倒平板時不要將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間，否則此培養(yǎng)基不能用來培養(yǎng)微生物。(2)平板倒置原因：平板皿蓋上會凝結(jié)水珠，培養(yǎng)基表面的溫度也較高，平板倒置后，既可使培養(yǎng)基表面的水分更好地揮發(fā)，又可防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染。(3)兩種純化方法的比較,單擊此處進入 隨堂達標檢測,旁欄思考題1．無菌

27、技術(shù)除了用來防止實驗室的培養(yǎng)物被其他外來微生物污染外，還有什么目的？解析　許多微生物對人類是有害的，因此實驗室中無菌技術(shù)還能有效避免操作者自身被微生物感染。答案　無菌技術(shù)還能有效避免操作者自身被微生物感染。,2．請你判斷以下材料或用具是否需要消毒或滅菌。如果需要，請選擇合適的方法。(1)培養(yǎng)細菌用的培養(yǎng)基與培養(yǎng)皿。(2)玻璃試管、燒瓶和吸管。(3)實驗操作者的雙手。解析　消毒和滅菌是無菌技術(shù)的兩項基本技術(shù)，實踐中需要根據(jù)無菌

28、操作的對象合理地選擇使用。原則是既要考慮使用的效果，又要考慮無菌操作對象的承受能力。答案　(1)、(2)需要滅菌；(3)需要消毒。,倒平板操作討論題1．培養(yǎng)基滅菌后，需要冷卻到50 ℃左右時，才能用來倒平板。你用什么辦法來估計培養(yǎng)基的溫度？答案　可以用手觸摸盛有培養(yǎng)基的錐形瓶，感覺錐形瓶的溫度下降到剛剛不燙手時，就可以進行倒平板了。2．為什么需要使錐形瓶的瓶口通過火焰？答案　通過灼燒滅菌，防止瓶口的微生物污染培養(yǎng)基。,3．平板

29、冷凝后，為什么要將平板倒置？答案　平板冷凝后，皿蓋上會凝結(jié)水珠，凝固后的培養(yǎng)基表面的濕度也比較高，將平板倒置，既可以使培養(yǎng)基表面的水分更好地揮發(fā)，又可以防止皿蓋上的水珠落入培養(yǎng)基，造成污染。4．在倒平板的過程中，如果不小心將培養(yǎng)基濺在皿蓋與皿底之間的部位，這個平板還能用來培養(yǎng)微生物嗎？為什么？答案　空氣中的微生物可能在皿蓋與皿底之間的培養(yǎng)基上滋生，因此最好不要用這個平板培養(yǎng)微生物。,平板劃線操作討論題1．為什么在操作的第一步以及

30、每次劃線之前都要灼燒接種環(huán)？在劃線操作結(jié)束時，仍然需要灼燒接種環(huán)嗎？為什么？答案　操作的第一步灼燒接種環(huán)是為了避免接種環(huán)上可能存在的微生物污染培養(yǎng)物；每次劃線前灼燒接種環(huán)是為了殺死上次劃線結(jié)束后，接種環(huán)上殘留的菌種，使下一次劃線時，接種環(huán)上的菌種直接來源于上次劃線的末端，從而通過劃線次數(shù)的增加，使每次劃線時菌種的數(shù)目逐漸減少，以便得到單個菌落。劃線結(jié)束后灼燒接種環(huán)，能及時殺死接種環(huán)上殘留的菌種，避免細菌污染環(huán)境和感染操作者。,2．在灼

31、燒接種環(huán)之后，為什么要等其冷卻后再進行劃線？答案　以免接種環(huán)溫度太高，殺死菌種。3．在做第二次以及其后的劃線操作時，為什么總是從上一次劃線的末端開始劃線？答案　劃線后，線條末端細菌的數(shù)目比線條起始處要少，每次從上一次劃線的末端開始，能使細菌的數(shù)目隨著劃線次數(shù)的增加而逐步減少，最終能得到由單個細菌繁殖而來的菌落。,涂布平板操作討論題涂布平板的所有操作都應(yīng)在火焰附近進行。結(jié)合平板劃線與系列稀釋的無菌操作要求，想一想，第2步應(yīng)如何進行

32、無菌操作？答案　應(yīng)從操作的各個細節(jié)保證“無菌”。例如，酒精燈與培養(yǎng)皿的距離要合適、吸管頭不要接觸任何其他物體、吸管要在酒精燈火焰周圍；等等。,練習(xí)1．提示　可以通過保持干燥、真空的條件，以及冷藏等方法來阻止微生物的生長。解析　可以從微生物生長需要哪些條件的角度來思考。例如，微生物的生長需要水、空氣、適宜的溫度等。,2．提示　相同點：三種培養(yǎng)技術(shù)都需要為培養(yǎng)物提供充足的營養(yǎng)。不同點：無土栽培技術(shù)的操作并不需要保證無菌的條件，而其他

33、兩種技術(shù)都要求嚴格的無菌條件。解析　可以從這三種培養(yǎng)技術(shù)的原理、操作步驟等方面分別進行總結(jié)歸納。,3．提示　巴斯德設(shè)計了一個鵝頸瓶(曲頸瓶)，現(xiàn)稱巴斯德燒瓶。燒瓶有一個彎曲的長管與外界空氣相通。瓶內(nèi)的溶液加熱至沸點，冷卻后，空氣可以重新進入，但因為有向下彎曲的長管，空氣中的塵埃和微生物不能與溶液接觸，使溶液保持無菌狀態(tài)，溶液可以較長時間不腐敗。如果瓶頸破裂，溶液就會很快腐敗變質(zhì)，并有大量的微生物出現(xiàn)。實驗得到了令人信服的結(jié)論：腐敗物質(zhì)

34、中的微生物是來自空氣中的微生物，這個實驗也導(dǎo)致了巴斯德創(chuàng)造了一種有效的滅菌方法——巴氏滅菌法。巴氏滅菌法又稱低溫滅菌法，先將要求滅菌的物質(zhì)加熱到65 ℃ 30 min鐘或72 ℃ 15 min，隨后迅速冷卻到10 ℃以下。這樣既不破壞營養(yǎng)成分，又能殺死細菌的營養(yǎng)體，巴斯德發(fā)明的這種方法解決了酒質(zhì)變酸的問題，拯救了法國釀酒業(yè)?，F(xiàn)代的食品工業(yè)多采取間歇低溫滅菌法進行滅菌。,解析　這是一道開放性的問題，答案并不唯一，重點在于鼓勵學(xué)生積極參與，