紅細(xì)胞血型血清學(xué)技術(shù)

1、紅細(xì)胞血型血清學(xué)技術(shù),,,標(biāo)本鹽水介質(zhì)凝集試驗(yàn)酶處理細(xì)胞的凝集試驗(yàn)抗球蛋白試驗(yàn)聚凝胺的應(yīng)用抗體效價(jià)滴定吸收放散試驗(yàn)?zāi)种圃囼?yàn),標(biāo)本,,（一）標(biāo)本采集1．紅細(xì)胞標(biāo)本,采集方法：針刺耳垂或指尖，直接用生理鹽水配成紅細(xì)胞懸液待用。靜脈采血，用抗凝劑（ACD、CPD、Na-EDTA等）抗凝。直接從血凝塊（血柱）中洗脫游離的紅細(xì)胞。,（一）標(biāo)本采集1．紅細(xì)胞標(biāo)本,★特殊情況：用于抗球蛋試驗(yàn)（Coomb’s試驗(yàn)）的

2、標(biāo)本要抗凝，否則，補(bǔ)體C3b、C4b容易致敏紅細(xì)胞造成抗球蛋試驗(yàn)（Coomb’s試驗(yàn)）假陽(yáng)性。存在有受Ca2+抑制的自身抗體時(shí)，不宜用抗凝血液作為紅細(xì)胞抗原標(biāo)本。,（一）標(biāo)本采集2．血清標(biāo)本,采集方法： 取靜脈血注入干燥試管內(nèi)，放置37℃水浴中，凝固后用玻璃棒攪動(dòng)血塊，使之與試管壁剝離，然后放置4℃冰箱過夜，離心分離血清。 必要時(shí)，當(dāng)血液凝固后即可離心分離血清。,（一）標(biāo)本采集2．血清標(biāo)本,★需注意的問題

3、：血清如需于4℃冰箱保存，需加疊氮鈉（NaN3）防腐，疊氮鈉（NaN3）終濃度0.1%。血清如用于制備試劑（如抗A、抗B標(biāo)準(zhǔn)血清）要經(jīng)過56℃滅活補(bǔ)體后才能使用。一般實(shí)驗(yàn)避免使用血漿，防止纖維蛋白的干擾。,（二）紅細(xì)胞懸液的配制用于血型鑒定、配血等的紅細(xì)胞至少要用大量生理鹽水洗一次，其目的是通過洗滌可以去除紅細(xì)胞表面的下列物質(zhì)：,1)少量的血漿蛋白；如纖維蛋白原等；2)已溶解紅細(xì)胞的基質(zhì)；他們有競(jìng)爭(zhēng)抗體的作用。,3)可溶性

4、的抑制物質(zhì)，如A、B、H、Lewis 等血型物質(zhì)；4)抗凝劑；他們有抗補(bǔ)體作用。,★紅細(xì)胞懸液的常用濃度,壓積紅細(xì)胞1滴加8滴生理鹽水所配成的懸液約為10%，按此比例配制其他所需濃度的紅細(xì)胞懸液。2%的紅細(xì)胞懸液一般用于滴定抗體效價(jià)。5%的紅細(xì)胞懸液一般用于血型鑒定、配血試驗(yàn)、及抗球蛋白試驗(yàn)等大多數(shù)血型血清學(xué)試驗(yàn)。10%的紅細(xì)胞懸液一般用于測(cè)定抗體的親和力試驗(yàn)。,★（三）標(biāo)本的保存,1．血清標(biāo)本沒有稀釋過的血清如加有防

5、腐劑可在4℃冰箱保存數(shù)月；在-20℃以下可保存數(shù)年而其抗體活性基本不變。用白蛋白或無(wú)抗體活性的AB型血清作稀釋劑稀釋血清后保存，效果和上述相同。用生理鹽水稀釋過的血清只限當(dāng)天使用，不能保存。用大分子物質(zhì)做稀釋介質(zhì)，其對(duì)抗體活性不起保護(hù)作用。,,2．紅細(xì)胞標(biāo)本一般試驗(yàn)用的在4℃冰箱保存下的凝血標(biāo)本要在5天內(nèi)使用，以不溶血為準(zhǔn)。ACD保存液或其它特制的保存液可保存紅細(xì)胞3周。鹽水配制的紅細(xì)胞懸液只能當(dāng)天使用，不宜保存。

6、應(yīng)注意的問題： 用作交叉配血的供血者、病人標(biāo)本（血清、細(xì)胞）要放4℃冰箱保存1周，以便在出現(xiàn)輸血反應(yīng)時(shí)可備查。 各種保存的紅細(xì)胞在使用前都要用鹽水洗一次以上。,,鹽水介質(zhì)凝集試驗(yàn),,原 理,鹽水介質(zhì)中紅細(xì)胞上的抗原決定簇與相應(yīng)抗體分子上的抗原結(jié)合部位結(jié)合，交叉連結(jié)形成肉眼可見的凝集塊。,★用 途：,鹽水介質(zhì)凝集試驗(yàn)用于IgM抗體的檢出、鑒定、鹽水配血試驗(yàn)。鹽水抗體鑒定的血型抗原，如ABO、MN、P等血型系統(tǒng)的

7、抗原。,例外情況：,在鹽水介質(zhì)中，凝集是IgM抗體的行為。ABO血型系統(tǒng)中的A、B抗原位點(diǎn)多，當(dāng)IgG抗A、抗B的濃度足夠大時(shí)，在鹽水介質(zhì)里也能與相應(yīng)的紅細(xì)胞發(fā)生凝集反應(yīng)。,鹽水介質(zhì)凝集試驗(yàn),(一)方法 常用的方法有平板法和試管法。,鹽水介質(zhì)凝集試驗(yàn)（二）、立即離心法：,用 途： 鹽水法鑒定血型和交叉配血時(shí)，多采用立即離心(immediate spin)法。正確的操作是紅細(xì)胞懸液加到血清中后立即離心并觀察結(jié)果。,★延遲立即

8、離心的后果： 反應(yīng)時(shí)間過長(zhǎng)而延誤立即離心的時(shí)間對(duì)ABO血型系統(tǒng)的抗體檢出影響較大。如果在室溫放置2分鐘后離心，可能使3+～4+的凝集減弱為0～1+，并伴有溶血現(xiàn)象。如果在室溫放置5分鐘后離心，原有的凝集可能消失，并有溶血。有的標(biāo)本在延遲離心后，本來(lái)應(yīng)有的凝集會(huì)變?yōu)榧炔荒膊蝗苎?，因而難以發(fā)現(xiàn)ABO血型的不配合，這多數(shù)發(fā)生在O型人的血清抗體與A型、B型或AB型紅細(xì)胞反應(yīng)的試驗(yàn)中，發(fā)生率為2%～3%。,★發(fā)生上述現(xiàn)象的原因：

9、 反應(yīng)強(qiáng)的抗A、抗B和抗原強(qiáng)度強(qiáng)的A、B抗原作用時(shí)，補(bǔ)體C1在有Ca2+存在的條件下，固定到紅細(xì)胞膜上，妨礙了紅細(xì)胞的凝集，進(jìn)一步可能引起溶血。,,★解決方法：血清與紅細(xì)胞混合后立即離心用血漿或滅活的血清做試驗(yàn)。用EDTA鹽水配制紅細(xì)胞懸液，以消除這種現(xiàn)象。稀釋血清后再做試驗(yàn)可消除這 種現(xiàn)象，因而也稱這種現(xiàn)象為前帶現(xiàn)象,（三）、試驗(yàn)結(jié)果的判讀和記錄,判讀結(jié)果前應(yīng)預(yù)先設(shè)計(jì)好記錄冊(cè)，在記錄冊(cè)上標(biāo)記好細(xì)胞樣本和

10、血清樣本的位置。一定要一邊觀察，一邊記錄結(jié)果，不能事后記錄。常用的記錄符號(hào)及所示的凝集強(qiáng)度如下:,（三）、試驗(yàn)結(jié)果的判讀和記錄,4+：一個(gè)大凝集塊，背景透明，無(wú)游離細(xì)胞。3+：:數(shù)個(gè)大凝集塊，背景透明，無(wú)游離細(xì)胞。2+：許多小凝集塊，肉眼可見，大小均勻，背景基本透明，有游離細(xì)胞。1+：很小的凝集塊，肉眼可見，背景不透明，游離細(xì)胞較多，常要用顯微鏡觀察。W+：:微小凝集塊，肉眼很難看清，背景渾濁，要用顯微鏡觀察。O：無(wú)凝集，無(wú)

11、溶血，全部是游離細(xì)胞，要用顯微鏡觀察。PH：部分溶血。H：完全溶血。,（四）緡錢狀凝集的處理,概 念：在鹽水介質(zhì)的凝集試驗(yàn)中，常見到緡錢狀凝集現(xiàn)象，也稱串錢狀凝集，這是一種假凝集，由紅細(xì)胞形成的這種假凝集就象許多硬錢幣堆積在一起。,★緡錢狀凝集的特點(diǎn)：,1在顯微鏡下紅細(xì)胞膜完整；2細(xì)胞間界限清晰地成緡錢串聚集；3緡錢狀假凝集反應(yīng)不不受溫度影響；,4 室溫與37℃結(jié)果一樣；5這種紅細(xì)胞的直接抗人球蛋白試驗(yàn)（Coomb

12、’s試驗(yàn)）呈陰性反應(yīng)。,★ （四）緡錢狀凝集的處理,造成紅細(xì)胞緡錢狀凝集的原因： 多種原因可以引起紅細(xì)胞緡錢狀凝集，有內(nèi)因和外因。,,內(nèi)在因素： 某些疾病致血漿球蛋白異常時(shí)，如高球蛋白血癥、巨球蛋白血癥時(shí)會(huì)出現(xiàn)緡錢狀凝集。外在因素：病人在使用大分子右旋糖酐和羥乙基淀粉溶液作血容量擴(kuò)張劑時(shí)，也可以產(chǎn)生緡錢狀凝集。用玻片法試驗(yàn)時(shí)，如溫度過高、時(shí)間過長(zhǎng)，也容易發(fā)生這種假凝集，因?yàn)椴Ｆ佑|面大，液體的蒸發(fā)面也大，致

13、使血清容易濃縮。,★緡錢狀凝集的解決方法：,實(shí)驗(yàn)中遇到緡錢狀凝集時(shí)，可將血清適當(dāng)稀釋后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。在顯微鏡下觀察到緡錢狀凝集時(shí)，加1滴生理鹽水到反應(yīng)物并混勻，通常可以消除這種假凝集。做試管法實(shí)驗(yàn)時(shí)如發(fā)現(xiàn)緡錢狀凝集，可將試管離心，去上清液，瀝干，再加2滴生理鹽水重新懸浮紅細(xì)胞觀察結(jié)果（這種方法稱為鹽水置換法），假凝集會(huì)消失，真凝集不會(huì)消失，嚴(yán)重的可重復(fù)一次。緡錢狀形成不影響間接抗球蛋白試驗(yàn)。,,酶處理細(xì)胞的凝集試驗(yàn),,★(一)、原理

14、,紅細(xì)胞表面有豐富的唾液酸，帶有負(fù)電荷，是紅細(xì)胞互相排斥的原因。蛋白水解酶能消化破壞這種唾液酸，減少紅細(xì)胞表面的負(fù)電荷。膠?；瑒?dòng)面上的Zeta電勢(shì)減小，紅細(xì)胞的間距縮短，IgG抗體分子能與有相應(yīng)抗原的紅細(xì)胞產(chǎn)生凝集。酶法能顯著增強(qiáng)Rh和Kidd系統(tǒng)的抗原抗體反應(yīng)，但蛋白酶能破壞M、N、S、s、Fya和Fyb抗原，酶法不適用這些抗原的檢測(cè)。,★(二)、常用酶的種類,常用的酶有菠蘿酶、木瓜酶、胰酶、無(wú)花果酶等。國(guó)內(nèi)用得較多的是菠蘿酶和木瓜酶

15、。注意事項(xiàng)：在配制酶溶液時(shí)要注意防護(hù)，有少數(shù)人對(duì)菠蘿酶、木瓜酶和無(wú)花果酶有過敏反應(yīng)，酶對(duì)組織有損傷作用，特別是無(wú)花果酶。各種酶粉都容易潮解，要注意密封，宜在4℃保存。,(三)、操作方法,1．一期法酶試驗(yàn) 一期法通常也稱為直接酶法，菠蘿酶和木瓜酶都適用于一期法。在已標(biāo)記好的試管中加2滴血清和1滴5%的紅細(xì)胞鹽水懸液，再加1滴酶溶液，37℃孵育15分鐘，離心1分鐘，觀察結(jié)果；或37℃孵育30分鐘后直接觀察結(jié)果。一期法不如二期法敏

16、感，但操作簡(jiǎn)單，用于抗體篩選和鑒定、Rh定型、交叉配血等比較方便。試驗(yàn)系統(tǒng)通常要設(shè)陰性對(duì)照、陽(yáng)性對(duì)照和自身對(duì)照。,,2．二期法酶試驗(yàn) 二期法也稱為間接酶法。木瓜酶和無(wú)花果酶適用于二期法。二期法分兩步完成。 第一步是酶處理紅細(xì)胞：在1份洗滌壓積的紅細(xì)胞中加2份木瓜酶溶液，37℃孵育30分鐘，用大量pH7.4的PBS洗滌3次，用生理鹽水配成5%的懸液備用。第二步是在己標(biāo)記好的試管中加受檢血清2滴，再加1滴酶處理過的紅

17、細(xì)胞懸液，37℃孵育15～30分鐘觀察結(jié)果，凝集和溶血皆屬于陽(yáng)性。如沒有反應(yīng)可轉(zhuǎn)入抗球蛋白試驗(yàn)。二期法也要設(shè)立與一期法相同的對(duì)照系統(tǒng)。一般用于抗體篩選和抗體鑒定試驗(yàn)。,(四)、酶處理紅細(xì)胞凝集素,一般概念： ★ 有一些抗體能和胰酶、木瓜酶、菠蘿酶等酶處理的細(xì)胞發(fā)生凝集，但不與未處理的細(xì)胞反應(yīng)，其原因尚不完全清楚，可能是酶處理后某些抗原部位得以暴露，且不同的酶暴露的部位不完全相同。對(duì)于這類與酶處理紅細(xì)胞才發(fā)生凝集的抗體稱為酶處理細(xì)胞

18、凝集素。,酶處理細(xì)胞凝集素有以下幾個(gè)特點(diǎn)：,1抗球蛋白法試驗(yàn)沒有反應(yīng)；或反應(yīng)微弱；常表現(xiàn)為自身凝集或全凝集；2可以和其他酶處理的細(xì)胞發(fā)生交叉反應(yīng)；3也可能不發(fā)生交叉反應(yīng)；4偶而有型特異性；,5多表現(xiàn)為Rh血型系統(tǒng)抗體特異性；6也可能表現(xiàn)為同種異體抗體特異性；7一些Rh系統(tǒng)的抗體，尤其是抗E和抗C與木瓜酶處理的細(xì)胞反應(yīng)強(qiáng)；8通常不引起輸血反應(yīng)。,,抗球蛋白試驗(yàn),,★（一）、概 念：,抗球蛋白試驗(yàn)（antigl

19、obulin test，AGT）又稱Coombs試驗(yàn)，是檢查IgG抗體的一種很好的方法。將抗球蛋白血清（antiglobulin serum，AGS）加入己致敏的紅細(xì)胞鹽水懸液中，紅細(xì)胞表面的抗體球蛋白（使其致敏的IgG抗體）與抗球蛋白血清中的抗體發(fā)生特異性反應(yīng)，使紅細(xì)胞發(fā)生凝集?？骨虻鞍籽宄丝梢詼y(cè)定紅細(xì)胞上IgG抗體外，還可以測(cè)定IgM和IgA，也可以測(cè)補(bǔ)體組分（C3、C4）。所謂廣譜AGS即包括抗IgG和抗C3?？骨虻鞍自?/p>

20、驗(yàn)分為直接抗球蛋白試驗(yàn)和間接抗球蛋白試驗(yàn)。,,抗球蛋白試驗(yàn),,（二）、抗球蛋白試劑：,試劑來(lái)源簡(jiǎn)介：用人體免球蛋白免疫家兔獲得。產(chǎn)量少，純度低，屬?gòu)V譜抗人球蛋白試劑。用雜交瘤技術(shù)制備單克隆抗球蛋白試劑。產(chǎn)量大，純度高，針對(duì)性強(qiáng)，多為單特異性抗球蛋白試劑，如抗IgG、?？笴3等，單克隆的廣譜抗人球蛋白試劑為抗IgG、抗C3的混合物。,,多特異性（廣譜）抗球蛋白試劑組成：試劑中含有抗IgG和抗C3d.。用途：主要用于配血試驗(yàn)、抗體篩

21、選、抗體鑒定以及直接抗球蛋白試驗(yàn)（DAT），如溶血性輸血反應(yīng)原因調(diào)查、新生兒溶血病檢查、自身免疫性溶液血性貧血（AIHA）的檢查等。,,單特異性抗球蛋白試劑試劑種類：有抗IgG、抗IgM、抗IgA、抗C3、抗C4。實(shí)際應(yīng)用以抗IgG、抗C3為主。用 途： 1、用于配血試驗(yàn)、抗體檢出和鑒定。 2、對(duì)多特異性（廣譜）抗球蛋白試驗(yàn)陽(yáng)性結(jié)果進(jìn)行分型。用抗IgG、抗C3可分出IgG、IgG+C3、C3三個(gè)型。,,I

22、gM抗體分子在紅細(xì)胞洗滌過程中容易解離，但同時(shí)致敏的補(bǔ)體能牢固地結(jié)合在紅細(xì)胞上而不易解離。因?yàn)榭笽gM抗體總是結(jié)合補(bǔ)體，因此，通過用抗C3測(cè)定紅細(xì)胞上是否結(jié)合有補(bǔ)體，則可間接證明紅細(xì)胞上是否有IgM抗體包被。冷抗體引起的自身免疫性溶血性貧血一般是補(bǔ)體型的?？笽gM在抗球蛋白試驗(yàn)中作用不大。,（三）、方 法,抗球蛋白試驗(yàn)分為直接抗球蛋白試驗(yàn)和間接抗球蛋白試驗(yàn)。,（一）、直接抗球蛋白試驗(yàn),★概 念： 直接抗球蛋白試驗(yàn)是檢查體內(nèi)致敏紅細(xì)胞

23、的一種方法，用 途： 用于檢查紅細(xì)胞是否已被不完全抗體所致敏。如新生兒溶血?。ㄌ杭t細(xì)胞被母親血型抗體致敏）、溶血性輸血反應(yīng)（輸入的不相合紅細(xì)胞被病人不完全抗體致敏）、自身免疫性溶血性貧血（病人紅細(xì)胞被自身抗體致敏）以及藥物誘導(dǎo)產(chǎn)生的自身抗體（由甲基多巴類藥物，青霉素等所致）。.,直接抗球蛋白試驗(yàn)（1）操作方法,1．取受檢查紅細(xì)胞，以生理鹽水洗滌3次，配成3%紅細(xì)胞鹽水懸液。2．取上述受檢者紅細(xì)胞鹽水懸液1滴，滴入試管，

24、加抗球蛋白血清1滴，混勻。3．陽(yáng)性對(duì)照：不完全抗D血清致敏的3%D陽(yáng)性紅細(xì)胞懸液1滴，加抗球蛋白血清1滴，混勻。.4．陰性對(duì)照：正常人3%D陽(yáng)性紅細(xì)胞懸液1滴加抗球蛋白血清1滴，混勻。5．受檢者以及陽(yáng)性，陰性對(duì)照管同時(shí)離心，觀察結(jié)果。,直接抗球蛋白試驗(yàn)（2）結(jié)果判定,如陽(yáng)性對(duì)照管凝集，陰性對(duì)照管不凝集，受檢紅細(xì)胞凝集者為陽(yáng)性，不凝集者為陰性。,直接抗球蛋白試驗(yàn)（3）注意事項(xiàng),1)標(biāo)本采取后立即進(jìn)行試驗(yàn)，延遲試驗(yàn)或中途停止可使抗體

25、從細(xì)胞上解離，造成假陰性結(jié)果。2)抗球蛋白血清應(yīng)按說(shuō)明書使用最適稀釋度，否則，可產(chǎn)生前帶和后帶反應(yīng)，而誤為陰性結(jié)果。,3)受檢紅細(xì)胞一定要用鹽水洗滌3次，除去紅細(xì)胞懸液中混雜的血清蛋白，以防止假陰性結(jié)果。4)如果要了解體內(nèi)致敏紅細(xì)胞的免疫球蛋白類型，可分別以抗IgG、抗IgM或抗C3單價(jià)抗球蛋白清進(jìn)行分型試驗(yàn)。,直接抗球蛋白試驗(yàn)·注意事項(xiàng),5)紅細(xì)胞上吸附抗體太少，或Coomb’s陰性的自身免疫性溶血性貧血，其直接

26、抗球蛋白試驗(yàn)可呈假陰性反應(yīng)。,6)全凝集或冷疑集血液標(biāo)本及含有Wharton膠（華通氏膠）的臍血標(biāo)本，且洗滌不充分；血液標(biāo)本中有很多網(wǎng)織紅細(xì)胞，且抗球蛋白血清中含有抗運(yùn)鐵蛋白時(shí)，都可使紅細(xì)胞產(chǎn)生凝集（假陽(yáng)性結(jié)果）。,（二）、間接抗球蛋白試驗(yàn),★概 念 它是一種檢測(cè)血清中不完全血型抗體的方法。即用已知抗原紅細(xì)胞測(cè)定受檢血清中相應(yīng)的不完全抗體，或用已知抗體的抗血清測(cè)定受檢紅細(xì)胞上相應(yīng)抗原。,間接抗球蛋白試驗(yàn),用 途：常用于血型鑒定，

27、抗體的檢出和鑒定，輸血前交叉配血試驗(yàn)以及其它的特殊研究。（1）操作方法1．取試管3支，標(biāo)明受檢管，陽(yáng)性對(duì)照及陰性對(duì)照。2．按下表將各反應(yīng)物加入相應(yīng)試管內(nèi)。,間接抗人球蛋白試驗(yàn)（1）操作步驟,反應(yīng)物： 受檢管，陽(yáng)性對(duì)照管，陰性對(duì)照管； 血清（已知或受檢），2滴2-5%紅細(xì)胞懸液（已知或受檢），1滴不完全抗D血清，2滴AB型血清，2滴5%D陽(yáng)性紅細(xì)胞懸液1滴。37℃水浴60min，洗滌3次。每管各加最適稀釋

28、度抗球蛋白血清1滴，混勻，離心，觀察結(jié)果。,間接抗人球蛋白試驗(yàn)（2）結(jié)果判定,陽(yáng)性對(duì)照管凝集，陰性對(duì)照管不凝集，受檢管出現(xiàn)凝集者為陽(yáng)性，受檢管不出現(xiàn)凝集者為陰性。效價(jià)滴定 如果受檢者血清中檢出IgG抗體，可將受檢者血清以鹽水做倍量稀釋后，按上法進(jìn)行測(cè)定。,間接抗人球蛋白試驗(yàn)（3）、注意事項(xiàng),紅細(xì)胞洗滌應(yīng)迅速，一開始洗滌就不應(yīng)中途停止。洗滌用鹽水要足量并用力沖入管底，使壓積于管底的紅細(xì)胞松離。切勿用手指堵住管口，顛倒混勻，以防污染來(lái)自

29、皮膚的蛋白。離心速度和時(shí)間十分重要，應(yīng)按規(guī)定進(jìn)行。如果檢查的抗體為補(bǔ)體依賴抗體，則必需加入新鮮AB型血清，抗球蛋白血清中也應(yīng)含有抗C3。,間接抗人球蛋白試驗(yàn)（四）、試劑對(duì)照細(xì)胞的制備,在直接和間接抗球蛋白試驗(yàn)中，陰性結(jié)果都要用IgG抗體致敏的試劑對(duì)照紅細(xì)胞檢查證實(shí)。,間接抗人球蛋白試驗(yàn)（四）、試劑對(duì)照細(xì)胞的制備,1、IgG致敏的試劑對(duì)照紅細(xì)胞 等量的IgG抗D+O型Rh(+)紅細(xì)胞于37℃水浴30分鐘，用大量的生理鹽水

30、洗滌3次后再用鹽水懸浮成5%的紅細(xì)胞即可。。,間接抗人球蛋白試驗(yàn)（四）、試劑對(duì)照細(xì)胞的制備,2、補(bǔ)體致敏的試劑對(duì)照紅細(xì)胞 20ml10%的蔗糖溶液+4～6滴新鮮血液，或加2滴洗滌過的壓積紅細(xì)胞和4滴AB型新鮮血清，37℃水浴15分鐘，用大量的生理鹽水洗滌3次后再用鹽水懸浮成5%的紅細(xì)胞即可。,間接抗人球蛋白試驗(yàn),★（五）、增強(qiáng)抗球蛋白試驗(yàn)的方法目的：加快抗體致敏速度或增強(qiáng)敏感性。1．酶 法：2．低離子介質(zhì)法：

31、3．牛白蛋白法：4．聚乙二醇（PEG）法：,,聚凝胺的應(yīng)用,,★（一）、原 理,聚凝胺（polybrene），一種高價(jià)陽(yáng)離子季胺鹽多聚物，溶解后能產(chǎn)生很多正電荷，可中和紅細(xì)胞表面的負(fù)電荷，使紅細(xì)胞之間距離減少，能引起正常紅細(xì)胞可逆性的非特異性凝集。如果是抗體致敏的紅細(xì)胞被聚凝胺凝集，則凝集不可逆。在檢測(cè)抗體活性的聚凝胺試驗(yàn)中紅細(xì)胞和血清首先在低離子介質(zhì)中孵育，促進(jìn)抗體與紅細(xì)胞結(jié)合，然后加入聚凝胺使細(xì)胞聚集。離心后，聚集的細(xì)胞不再懸

32、浮，加入重新懸浮液，聚凝胺的聚集作用可通過加入枸櫞酸鈉而中和，使正常紅細(xì)胞的聚集解散，而抗體引起的凝集仍存在。,聚凝胺試驗(yàn)原理,（二）試劑和材料,1．低離子介質(zhì)（LIM）2．聚凝胺3．重新懸浮液（枸櫞酸三鈉）,（三）操作方法,1．在試管中加2滴受檢血清或試劑血清，1滴2%～5%受檢紅細(xì)胞或試劑紅細(xì)胞，混勻。2．加LIM溶液0.6ml，混合均勻，室溫孵育1min。3．加2滴0.05%聚凝胺溶液，混合后靜置15s。4．1

33、300g/min，離心15s，傾去上清液。不再懸浮細(xì)胞。5．輕輕搖動(dòng)試管，目測(cè)細(xì)胞有無(wú)凝集，如無(wú)凝集，必須重做。6．加入2滴重新懸浮液，并輕輕混合，觀察結(jié)果。,（四）結(jié)果判定,如凝集散開，則為聚凝胺引起的非特異性凝集，為陰性反應(yīng)；如.凝集不散開，則為抗原抗體結(jié)合的特異性反應(yīng)，為陽(yáng)性反應(yīng)，如肉眼觀察凝集強(qiáng)度弱，可進(jìn)一步在顯微鏡下觀察有無(wú)凝集。,（五）注意事項(xiàng),1．可以用含ETDA之血漿代替血清。2．當(dāng)重新懸浮液加入后，應(yīng)盡快觀察

34、結(jié)果（不可超過3min，以免反應(yīng)消失）。3．0.05%聚凝胺溶液若放在玻璃瓶太久會(huì)變?nèi)?，所以必須保存在塑料瓶中?．聚凝胺是一種抗肝素藥物，所以使用含肝素之標(biāo)本，要加稍多之聚凝胺來(lái)中和肝素。,,抗體效價(jià)滴定,,（一）、概 念、注意事項(xiàng),★將血清在稀釋液中連續(xù)倍比稀釋后，與特定抗原的紅細(xì)胞在特定的反應(yīng)介質(zhì)中進(jìn)行凝集反應(yīng)，通常以肉眼觀察到的最后一個(gè)“1+”的凝集管作為判斷反應(yīng)終點(diǎn)，終點(diǎn)管血清的稀釋倍數(shù)的倒數(shù)則為該抗體的效價(jià)，或稱為滴度。

35、,,注意點(diǎn)： 效價(jià)滴定屬半定量試驗(yàn)，間接推測(cè)抗體濃度有一定實(shí)用價(jià)值，但用它來(lái)測(cè)定抗體含量是不準(zhǔn)確的。因?yàn)椋?這種效價(jià)只表示結(jié)合到紅細(xì)胞上抗體的量。只是親合力大的抗體結(jié)合到紅細(xì)胞上。 終點(diǎn)觀察方法不同，數(shù)據(jù)結(jié)果也不同。 （肉眼、顯微鏡）所用的指示紅細(xì)胞的抗原性強(qiáng)弱不同結(jié)果也有差異。 人為誤差大。操作者手法和環(huán)境溫度等都會(huì)影響結(jié)果。,,★根據(jù)抗體的血清學(xué)行為性質(zhì)而選用不同的效價(jià)測(cè)定

36、方法。如抗體分子屬IgM性質(zhì)（如抗A、抗B、抗M等）則用鹽水介質(zhì)法；抗體分子屬IgG性質(zhì)則選用檢測(cè)不完全抗的方法，如酶法、抗球蛋白法、聚凝胺法等。,,★(二)、IgM與IgG抗體分子的區(qū)別(見免疫血液學(xué)基礎(chǔ)),2．巰基化學(xué)試劑滅活I(lǐng)gM分子的原理：,IgM分子由5個(gè)輻射狀排列的亞單位組成，亞基間以二硫鍵相連。亞基間的二硫鍵比亞基內(nèi)的鏈間及鏈內(nèi)二硫鍵容易被巰基化學(xué)試劑破壞，經(jīng)巰基化學(xué)試劑（2-Me、DTT等）處理后，19S的IgM分子成為

37、與IgG和IgA單體一樣的7S分子，使IgM抗體失去原來(lái)的血清學(xué)性質(zhì)，失去其與相應(yīng)紅細(xì)胞凝集的能力。IgG抗體分子則不被巰基化學(xué)試劑滅活，保持與相應(yīng)紅細(xì)胞致敏的血清學(xué)特性。IgA抗體分子可部分被滅活（7S單體不受影響，9S及11S多聚體被滅活）。,小 結(jié)★,2-巰基乙醇簡(jiǎn)稱為2-Me；二硫蘇糖醇簡(jiǎn)稱為DTT。它們都有滅活I(lǐng)gM抗體的能力。抗A、抗B抗體一般為IgG+IgM混合型。IgG和IgM型抗體具有相同特異性。其中的IgG型抗體對(duì)

38、新生兒溶血病有臨床意義，因IgM抗體能在鹽水介質(zhì)中凝集紅細(xì)胞而掩蓋了IgG抗體的凝集，所以在檢測(cè)IgG抗體前必須將起干擾作用的IgM抗體破壞，常用的方法是巰基化學(xué)試劑處理法。,,吸收放散試驗(yàn),,吸收試驗(yàn),本試驗(yàn)用以間接證明紅細(xì)胞上的血型抗原及其強(qiáng)度，常用于ABO亞型的鑒定，全凝集紅細(xì)胞的定型以及某種原因引起紅細(xì)胞血型抗原減弱時(shí)的定型等。當(dāng)受檢細(xì)胞加入已知效價(jià)的抗A及抗B血清后，若紅細(xì)胞上有相應(yīng)的抗原，便吸收血清中的抗體，使抗體活性減弱或

39、消失。再以已知抗原的紅細(xì)胞來(lái)滴定抗體效價(jià)，比較吸收前后抗血清中抗體的效價(jià)，便可證明受檢紅細(xì)胞上有無(wú)相應(yīng)抗原以及強(qiáng)度。間接判定受檢紅細(xì)胞的血型及其亞型的種類。,,吸收試驗(yàn)也用于自身抗體的吸收、一份血清中幾種特異性抗體的分離及鑒定、低濃度抗體的濃縮等。,放散試驗(yàn),紅細(xì)胞上的抗原與血清中的抗體在適合條件下發(fā)生凝集或致敏。這種結(jié)合是可逆的，如果改變某些物理?xiàng)l件，抗體又可從結(jié)合的細(xì)胞上放散出，再以相應(yīng)紅細(xì)胞鑒定放散液內(nèi)抗體的種類，并測(cè)定其強(qiáng)度。用

40、以判定待檢紅細(xì)胞上抗原的型別。這種方法常用于ABO亞型的鑒定，全凝集或多凝集紅細(xì)胞的定型，類B的鑒定以及新生兒溶血病的診斷等。放散試驗(yàn)的方法很多，ABO血型，IgM抗體以熱放散法為常用。Rh血型，IgG抗體以乙醚放散法為常用。,,凝集抑制試驗(yàn),,,★概 念：抗體能與有相應(yīng)抗原的紅細(xì)胞發(fā)生特異性凝集反應(yīng)，體液中的可溶性抗原物質(zhì)能與該抗體發(fā)生特異的中和反應(yīng)，抑制抗體凝集紅細(xì)胞的作用。用這種可溶性物質(zhì)來(lái)抑制抗體與紅細(xì)胞凝集作用的試驗(yàn)，稱為

41、凝集抑制試驗(yàn)。,,★用 途：常用于HAB血型物質(zhì)或Lewis分泌狀態(tài)的檢查。幫助ABO亞型的確定。特殊情況下（如紅細(xì)胞標(biāo)本完全溶血）ABO血型鑒定。,(一) 唾液HAB血型物質(zhì)測(cè)定原理,HAB血型物質(zhì)除存在于人紅細(xì)胞上，也存在于某些人的分泌液中，含有血型物質(zhì)者稱為分泌型，約占80%，反之稱為非分泌型約占20%。A型分泌型人唾液中含有A型物質(zhì)，B型分泌型人唾液中含有B型物質(zhì)，O型分泌型人唾液中含有H型物質(zhì)，AB型分泌型人唾液中含有

42、A及B型物質(zhì)。H型物質(zhì)在A、B、O及AB四型分泌型唾液中均存在，但以O(shè)型人含量最多。,(續(xù)) 唾液HAB血型物質(zhì)測(cè)定原理,唾液中HAB血型物質(zhì)為半抗原，是糖蛋白，能特異性地與相應(yīng)抗體結(jié)合，從而抑制抗體與相應(yīng)紅細(xì)胞發(fā)生凝集。所以，利用抑制凝集試驗(yàn)，可測(cè)定唾液中HAB血型物質(zhì)，它有助于ABO亞型的分類及其特殊情況下血型鑒定。,（二）試劑和材料,1．唾液的留取 2．2%A、B和O型紅細(xì)胞鹽水懸液。3．最適稀釋度抗血清的制備。4．抗H血