疾病產(chǎn)生的分子基礎(chǔ)藥學(xué)

1、1,第十一章 疾病產(chǎn)生的分子基礎(chǔ),湯立軍 研究員,中南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院分子生物學(xué)研究中心,2,人類疾病如白血病、惡性腫瘤、糖尿病、神經(jīng)退行性疾病、心腦血管、高血壓等發(fā)生和發(fā)展都涉及到有關(guān)蛋白質(zhì)及其復(fù)合物的結(jié)構(gòu)、功能和相互作用異常。疾病的本質(zhì)是蛋白質(zhì)功能紊亂，基本原理是各種原因引起蛋白質(zhì)質(zhì)和量的改變。,,3,1.基因結(jié)構(gòu)的改變； 2.受細(xì)胞調(diào)節(jié)因素或其它因素影響使基因的表達(dá)發(fā)生改變； 3.外來的致病基因； 4.蛋白質(zhì)翻譯后加

2、工及蛋白質(zhì)降解發(fā)生變化。,蛋白質(zhì)功能紊亂的原因各不相同，具有不同分子機(jī)制。,4,第一節(jié) 基因結(jié)構(gòu)改變與疾病 第二節(jié) 細(xì)胞間信號異常與疾病第三節(jié)  細(xì)胞內(nèi)因素與疾病第四節(jié)  翻譯后加工運輸障礙與疾病第五節(jié)  蛋白質(zhì)降解異常與疾病第六節(jié) 病原微生物基因引起的疾病第七節(jié)  疾病分子機(jī)制的研究策略,5,第一節(jié) 基因結(jié)構(gòu)改變與疾病一、基因突變二、基因突變的遺傳學(xué)效應(yīng)三、結(jié)構(gòu)基因變異導(dǎo)

3、致的疾病四、調(diào)控序列變異導(dǎo)致基因表達(dá)水平變化,6,一、基因突變的多種類型,點突變是單個堿基的替換缺失是一個或多個核苷酸的丟失插入是一個或多個核苷酸的增加倒位是一段核苷酸序列染色體位置的改變基因突變還分為配子突變與體細(xì)胞突變動態(tài)突變指串聯(lián)重復(fù)拷貝數(shù)隨世代的傳遞而改變,7,例脆性X綜合征,“CCG”重復(fù)發(fā)生在FMR1（脆性X智力低下基因1）的5 ´非翻譯區(qū)，拷貝數(shù)不穩(wěn)定。 8~50拷貝 (正常人) 52~20

4、0拷貝 (攜帶者) 200~1000拷貝 (患者),8,強(qiáng)直性肌營養(yǎng)不良 DMPK基因3´非翻譯區(qū)CTG三核苷酸序列異常重復(fù)擴(kuò)增超過100（正常人為5～ 40），重復(fù)數(shù)目與癥狀嚴(yán)重性相關(guān) ；Huntington舞蹈病 huntington基因內(nèi)的CAG三核苷酸序列異常重復(fù)擴(kuò)增，亨廷頓病患者35～100個或更多（正常人為11～30）；Friedreich共濟(jì)失調(diào)癥 內(nèi)含子CAA拷貝數(shù)過度增加。,9,1.堿基置換

5、突變 (substitution mutation),二、不同的基因突變引起不同的遺傳效應(yīng),a.錯義突變 (missense mutation),b.無義突變 (nonsense mutation),c.同義突變 (consense mutation),10,a. 錯義突變（missense mutation）指DNA改變后mRNA中相應(yīng)密碼子發(fā)生改變，編碼另一種氨基酸，使蛋白質(zhì)中的氨基酸發(fā)生改變。,有些錯義突變不影響蛋白質(zhì)或酶的生物活

6、性，不表現(xiàn)出明顯的表型效應(yīng)。,11,b.無義突變 (nonsense mutation),亮氨酸的密碼子UUA，中間的U變?yōu)锳這樣一個堿基變化就會成為（終止密碼子）UAA。,酪氨酸的密碼子是UAC，置換突變使UAC變?yōu)槊艽a子UAG后翻譯便終止。,UAG、UGA、UAA終止密碼子,12,c.同義突變(synonymous mutation)：密碼子發(fā)生改變, 但所編碼的氨基酸不變。,例如：CUU CUC CUG → 亮氨酸,13,

7、2. 缺失或插入突變(deletion or insertion mutation) a.密碼子缺失或插入 b.移碼突變(frame-shift mutation) c.整基因或大片段缺失,14,a.密碼子缺失或插入,CTG ACT CCT GAG GAG AAG TCT Leu Thr Pro Glu Glu Lys Ser,CTG ACT GAG GAG AA

8、G TCT Leu Thr Glu Glu Lys Ser,CTG ACT CC G GAG AAG TCT Leu Thr Pro Glu Lys Ser,,C CT CCT GAG GAG AAG TCT Pro Pro Glu Glu Lys Ser,15,,b.移碼

9、突變,CTG ACT CCT GAG GAG AAG TCT Leu Thr Pro Glu Glu Lys Ser,TG ACT CCT GAG GAG AAG TCT,TGA CTC CTG AGG AGA AGT CT,CT ACT CCT GAG GAG AAG TCTCTA CTC CTG AGG AGA AGT CT Leu Leu Leu Arg Arg Ser

10、,,插入或缺失帶來的無義突變,CTG ACT CCT GAG GAG AAG TCT Leu Thr Pro Glu Glu Lys Ser,16,3.融合突變(fusion mutation) 細(xì)胞減數(shù)分裂時同源染色體不等交換而致基因間錯位配對, 產(chǎn)生兩種含不同等位基因的染色體。,17,18,19,白血病中部分常見的融合基因,20,4.基因突變影響 hnRNA 的剪接,基因突變發(fā)生在

11、hnRNA 的一級結(jié)構(gòu)上特定的剪接位點上，形成新的剪接位點或使正常剪接位點消失，導(dǎo)致 hnRNA 的剪接錯誤，產(chǎn)生異常的 mRNA，最終產(chǎn)生異常的蛋白表達(dá)產(chǎn)物，改變生物性狀。,21,真核生物基因的剪接位點：由內(nèi)含子的5′端“GT”和3′端“AG”，及內(nèi)含子和外顯子內(nèi)的其它調(diào)控元件共同決定。,22,,例：家族性孤立性生長激素缺乏Ⅱ型遺傳病 由于GH-1基因的EXONⅢ上第5nt由G→A，破壞一個ESE，使EXONⅢ被跳過，而最

12、終造成編碼蛋白縮短，影響功能。,23,,轉(zhuǎn)入了人缺陷型的GH-1基因,,利用RNAi使導(dǎo)入基因沉默,2007年,24,25,三 結(jié)構(gòu)基因改變導(dǎo)致蛋白質(zhì)變化引起疾病,結(jié)構(gòu)基因發(fā)生改變會改變蛋白質(zhì)的一級結(jié)構(gòu)，進(jìn)而改變蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)。,26,1.蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)變化引起的疾?。?） 血紅蛋白病 (hemoglobinopathy),27,血紅蛋白結(jié)構(gòu),血紅蛋白是由4條肽鏈（兩個α和兩個β鏈）組成的。每條肽鏈都類似于肌紅蛋白的肽鏈，都結(jié)合一個

13、血紅素。,28,血紅蛋白病——鐮刀形細(xì)胞貧血癥,29,,30,血紅蛋白病分子基礎(chǔ),31,血紅蛋白病分子基礎(chǔ),32,（2）家族性高膽固醇血癥　　一種常染色體顯性遺傳疾病，其特征為低密度脂蛋白（LDL）-膽固醇水平明顯升高，可出現(xiàn)黃色瘤和動脈硬化癥。 病因：肝臟表面特異性的LDL-受體數(shù)目減少或缺乏，導(dǎo)致肝臟對血循環(huán)中LDL-膽固醇的清除能力下降，進(jìn)而引起血循環(huán)中LDL-膽固醇水平升高。,33,LDL 受體基因變異，導(dǎo)致其編碼蛋白

14、結(jié)構(gòu)異常，功能下降或完全喪失。 配體結(jié)合結(jié)構(gòu)域，由LDL受體蛋白N端292個氨基酸殘基組成，富含半胱氨酸。該結(jié)構(gòu)中有7個由40個氨基酸殘基組成的重復(fù)序列(天冬-半胱-X-天冬-甘-絲-天冬-谷)，每個重復(fù)序列中含有6個半胱氨酸殘基，全部42個半胱氨酸。,34,35,2.蛋白質(zhì)合成量變化引起的疾病,36,人珠蛋白基因簇及珠蛋白基因結(jié)構(gòu),37,珠蛋白基因的表達(dá)在時空上受到遺傳因素的精確調(diào)控，表現(xiàn)為以下特點： 組織特異性 發(fā)育

15、階段特異性 協(xié)同性,38,α-地貧基因缺失類型,,,,,,,α1,α2,正常,,,,,,,基本正常,αα,αα+,,,,,,,輕度貧血,α + α+,,,,,,,輕度貧血,αα0,,,,,,,高度貧血,α + α0,,,,,,,Hb Bart’s綜合征,α 0 α0,39,β珠蛋白結(jié)構(gòu)基因突變抑制β珠蛋白合成使β珠蛋白量減少甚至完全缺失,引起β-地貧,第17位賴氨酸密碼子AAG (Lys) → TAG, 發(fā)生無義突變,引起β

16、0地貧;β珠蛋白基因的編碼順序內(nèi)插入或缺失1、２、４或７個核苷酸，會使突變點以后的讀碼框遭到破壞，往往造成β-珠蛋白肽鏈合成提前終止，而引起β0地貧。,40,四、調(diào)控序列變異導(dǎo)致基因表達(dá)水平變化,順式作用元件的基因突變，會降低β珠蛋白基因的轉(zhuǎn)錄，使β珠蛋白合成減少，引起β+-地貧。,TATA盒：-32（C→A)、-30(T→C)、-29(A→G)、-28(A→G)。CAAT盒：-101、-92、-88、-87、-86等位點的點突變。

17、,,41,啟動子和外顯子1之間大于10kb的缺失;另一種是啟動子和外顯子1之間大于6kb的缺失。兩種突變都使LDL受體基因的表達(dá)能力完全喪失。,LDL受體啟動子變異,42,一些內(nèi)含子的變異也會影響蛋白質(zhì)的合成，使體內(nèi)相應(yīng)蛋白質(zhì)含量減少或缺失。 Apo B100 基因內(nèi)含子的第一個堿基會發(fā)生G→T突變，突變基因轉(zhuǎn)錄后生產(chǎn)的hnRNA，會影響Apo B100 mRNA的正常剪切。,43,第二節(jié) 細(xì)胞間信號異常導(dǎo)致基因

18、表達(dá)異常引起疾病,人體各細(xì)胞間通過激素、神經(jīng)遞質(zhì)、旁分泌信號等保持細(xì)胞間的聯(lián)系，調(diào)節(jié)彼此的代謝。基因表達(dá)也受到細(xì)胞間信號的調(diào)控。,44,AFP 接受異常細(xì)胞增殖信號成為肝癌發(fā)生的重要因素,胚胎發(fā)育過程中, AFP增強(qiáng)子激活,而沉寂子處于抑制狀態(tài)。胎兒出生后, AFP沉寂子處于活化狀態(tài),阻礙增強(qiáng)子的啟動效應(yīng)。在異常細(xì)胞增殖信號的作用下, c-myc、c-fos、c-jun等癌基因表達(dá)異常增加,其表達(dá)產(chǎn)物與 AFP基因順式作用元件結(jié)合,

19、激活 AFP基因表達(dá)。,45,粉塵刺激 → 肺支氣管上皮、肺泡巨噬細(xì)胞 → 分泌TGF-β1→ 成纖維細(xì)胞 → 促細(xì)胞分裂和ECM 蛋白基因表達(dá) → ECM 增加 → 矽肺發(fā)生,塵肺是由于長期吸入大量含游離二氧化硅粉塵引起的以肺纖維化為主要病變的疾病,46,第三節(jié) 細(xì)胞內(nèi)因素導(dǎo)致基因 表達(dá)異常引起疾病,異常的細(xì)胞內(nèi)信號 持續(xù)高血糖引起的糖尿病心肌病 高血糖 → DAG↑ → ⊕PKC → ⊕ ACE → AngⅡ↑

20、 →心肌重塑、心肌肥大。,47,異常的DNA甲基化（不同的DNA甲基化模式形成不同的表觀遺傳特征）hCG5´轉(zhuǎn)錄起始區(qū)低甲基化→非滋養(yǎng)層細(xì)胞hCG ↑ →受體結(jié)合→ ⊕cAMP →Tumor ↑,48,,Proteins complexed with DNA allow for more “open” structure; can be transcribed….,Methylation leads to change in

21、 chromatin structure; more condensed state is transcriptionally inactive…genes are “off ” …,49,第四節(jié)  翻譯后加工運輸障礙與疾病,50,白化 Albinism,51,酪氨酸酶與Ⅰ型泛素性白化病,酪氨酸酶催化結(jié)構(gòu)域點突變可以使酪氨酸酶的活性降低甚至消失,黑色素合成減少或不能合成,導(dǎo)致Ⅰ型泛素性白化病;酪氨酸酶催化結(jié)構(gòu)域以外的點突變

22、也能導(dǎo)致色素缺失,蛋白質(zhì)不能正確折疊.沒有正常折疊的酪氨酸酶不能從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)輸出而滯留在內(nèi)質(zhì)網(wǎng),無法完成其成熟及運輸過程。,52,蛋白轉(zhuǎn)運異常,酪氨酸酶,P蛋白,高爾基體,黑色素體,P蛋白基因突變,,黑色素合成障礙引起Ⅱ型泛發(fā)性白化病,內(nèi)質(zhì)網(wǎng),,,酪氨酸酶與Ⅰ型泛素性白化病,53,第五節(jié)  蛋白質(zhì)降解異常與疾病,54,蛋白質(zhì)降解途徑 溶酶體途徑，降解細(xì)胞吞入的胞外蛋白質(zhì)泛素-蛋白酶體途徑，降解胞內(nèi)泛素化的蛋白質(zhì)

23、 泛素(ubiquitin, Ub) E1(特異性泛素激活酶) E2(泛素結(jié)合酶), E3(泛素連接酶) 蛋白酶體(proteasome),蛋白的降解,55,56,泛素-蛋白酶體系統(tǒng)活性被異常抑制或激活均可導(dǎo)致機(jī)體紊亂。,2004 年諾貝爾化學(xué)獎,阿龍·切哈諾沃(Aaron　Ciechanover),阿夫

24、拉姆·赫什科(Avram　Hershko),歐文·羅斯(Irwin　Rose),57,高血脂:載脂蛋白的過度降解,泛素-蛋白酶體系統(tǒng)在維持正常載脂蛋白含量中起到重要的作用，該系統(tǒng)功能障礙，會導(dǎo)致載脂蛋白含量異常。Apo AⅠ, Apo B100, Apo E, etc.,58,阿爾茨海默病:蛋白酶體活性的抑制,阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease, AD）是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變的疾病。臨床上首

25、先表現(xiàn)為近期記憶力降低,繼而表現(xiàn)持續(xù)性智能衰退、失語、判斷推理能力喪失,以及運動障礙等。AD最顯著的神經(jīng)病理組織學(xué)特征是老年斑和神經(jīng)原纖維纏結(jié)?，F(xiàn)已發(fā)現(xiàn),β-淀粉樣蛋白在老年斑的形成過程中起十分重要的作用 。,59,第六節(jié) 病原微生物基因引起的疾病,感染引起機(jī)械或生物學(xué)損傷；爭奪營養(yǎng)造成營養(yǎng)缺乏；毒素引起細(xì)胞代謝功能異常；基因整合到宿主基因組，造成基因結(jié)構(gòu)改 變和表達(dá)異常。,60,第七節(jié) 基因結(jié)構(gòu)和表達(dá)與疾病的研究策略,

26、1.通過基因結(jié)構(gòu)分析確定基因變異 核糖核酸酶切分析、雜合雙鏈分析、 化學(xué)切割錯配、酶促切割錯配,3.通過功能學(xué)研究確定致病基因 轉(zhuǎn)基因技術(shù)、基因敲除、 反義技術(shù)、基因誘導(dǎo)超表達(dá),2.基因表達(dá)水平分析 差異顯示、抑制消減雜交、基因表達(dá)系列分析,61,基本原理: 在一定條件下，異源雙鏈核酸分子RNA：RNA或RNA：DNA中錯配堿基可被核糖核酸酶RNase識別并切割，通過凝膠電泳分析酶切片段的大小，即可確定錯

27、配的位置。,一、基因結(jié)構(gòu)分析,1.核糖核酸酶切分析（RNase cleavage）,62,,,？,63,,,64,,,,,,電泳分離,65,缺點：當(dāng)RNA探針上錯配的堿基為嘌呤時，核糖核酸酶切割效率低甚至不切割；分析DNA的一條鏈，突變檢出率為 30%；同時分析DNA的兩條鏈，突變檢出率為 70%；需要制備特異性的RNA探針,66,2.雜合雙鏈分析法（heteroduplex analysis, HA）,3. 化學(xué)切割錯配法（

28、Chemical cleavage of mismatch, CCM）,4.酶促切割錯配 (enzyme mismatch cleavage),67,測序：雙脫氧自動化序列分析SSCP：單鏈構(gòu)象多態(tài)性分析RFLP：限制性酶切長度多態(tài)性DNA芯片技術(shù)AS-PCR技術(shù)ASO雜交技術(shù)MS-PCRDGGE等,68,基因表達(dá)系列分析(Serial Analysis of Gene Expression, SAGE),是一種用于定量

29、、高通量基因表達(dá)分析的實驗方法(Velculescu et al., 1995)。SAGE原理: 分離每個轉(zhuǎn)錄本特定位置的較短單一的序列標(biāo)簽（約9-11個堿基對），這些短的序列被連接、克隆和測序，特定的序列標(biāo)簽的出現(xiàn)次數(shù)就反應(yīng)了對應(yīng)基因的表達(dá)豐度。,二、基因表達(dá)水平分析,69,Serial analysis of gene expression (SAGE) 技術(shù)流程,70,三、基因功能的研究,轉(zhuǎn)基因技術(shù)基因打靶反義寡核苷酸技術(shù)

30、反義RNA技術(shù)核酶技術(shù)RNA干擾技術(shù)基因誘導(dǎo)超表達(dá)技術(shù),,反義技術(shù),71,1. 轉(zhuǎn)基因技術(shù),指在生物基因組中帶有插入或整合的外源基因，生物個體能將它傳給后代，并表達(dá)出該基因的生物活性物質(zhì)，從而使受體生物獲得新的性狀。,72,采用基因轉(zhuǎn)移技術(shù)使目的基因整合入受精卵細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞，然后將細(xì)胞導(dǎo)入動物子宮，使之發(fā)育成個體。,轉(zhuǎn)基因—— 被導(dǎo)入的目的基因轉(zhuǎn)基因動物(transgenic animal)—— 目的基因的受體動物,73,

31、轉(zhuǎn)基因動物操作技術(shù)流程,獲取外源目的基因 含有外源目的基因的重組載體導(dǎo)入生殖細(xì)胞或胚胎干細(xì)胞 選擇攜帶目的基因的細(xì)胞，選擇體外培養(yǎng)系統(tǒng)和宿主動物 轉(zhuǎn)基因胚胎的發(fā)育及鑒定 篩選所得的轉(zhuǎn)基因動物,,,,,簡明操作步驟,74,轉(zhuǎn)基因動物實例一,超級奶牛－普通奶牛的三倍大 （英國）,75,just a joke,,76,2. 基因打靶(gene targeting),通過D

32、NA定點同源重組，改變基因組中的某一特定基因，在生物活體內(nèi)研究該基因的功能?；蚯贸?gene knockout)：定向敲除基因敲入(gene knockin)：定向替代,77,Marrio Capecchi于八十年代末在Utah大學(xué)發(fā)展起來。實驗動物通常是小鼠，被敲除了功能基因的小鼠就稱為敲除小鼠(knockout mice)。基因敲除技術(shù)是研究基因功能的一項非常有用的技術(shù)(遺傳病研究、研究特定基因的細(xì)胞生物學(xué)活性以及研究發(fā)育調(diào)

33、控的基因作用）?；蚯贸且惶捉M合技術(shù)，包括基因重組、細(xì)胞分離培養(yǎng)、轉(zhuǎn)基因等。,78,基因打靶的必備條件,胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)能在體外培養(yǎng)，保留發(fā)育的全能性打靶載體Neo（新霉素）陽性篩選標(biāo)志HSV-tk陰性篩選標(biāo)志：單純皰疹病毒(herpes simplex virus) 胸腺嘧啶激酶(thymidine kinase),,,79,基因敲除的基本程序,打靶載體的構(gòu)建打靶載體導(dǎo)入ES細(xì)胞：重組置換基因敲除ES細(xì)胞注射入

34、胚泡胚泡植入假孕小鼠的子宮中嵌合體的雜交育種,,,80,81,,美國猶他大學(xué)Mario R. Capecchi,美國北卡羅來納州大學(xué)Oliver  Smithies,英國卡迪夫大學(xué) Martin J. Evans,2007年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎:基因打靶,82,3. 反義技術(shù),83,核酶技術(shù)確定基因在疾病中的作用,（1） RNA分子，催化核糖體RNA中內(nèi)含子的自我拼接；除了催化RNA的剪切，還可催化DNA的剪切、RN

35、A的聚合、RNA鏈的復(fù)制等。（2）優(yōu)點:其底物的堿基配對特異性。核酶與底物結(jié)合常形成“發(fā)夾”結(jié)構(gòu)或“錘頭”結(jié)構(gòu)。（3）設(shè)計核酶特異性地結(jié)合于靶點，以其本身酶活性進(jìn)行剪切。,84,核酶的作用機(jī)制,85,與一般的反義RNA相比，核酶具有較穩(wěn)定的空間結(jié)構(gòu)，不易受到RNA酶的攻擊。更重要的是，核酶在切斷mRNA后，又可從雜交鏈上解脫下來，重新結(jié)合和切割其它的mRNA分子。,86,4. RNA干擾（RNA interference，RNAi）

36、,內(nèi)源性或外源性雙鏈RNA介導(dǎo)的細(xì)胞內(nèi)mRNA發(fā)生特異性降解，導(dǎo)致靶基因的表達(dá)沉默，產(chǎn)生相應(yīng)的功能表型的缺失現(xiàn)象。,87,共抑制現(xiàn)象的發(fā)現(xiàn),ＲＮＡｉ研究的早期線索早在20年前,來自于美國和荷蘭的兩個轉(zhuǎn)基因植物實驗組Rich Jorgensen和同事,在對矮牽牛(petunias)進(jìn)行的研究中有個奇怪的發(fā)現(xiàn):將一個能產(chǎn)生色素的基因置于一個強(qiáng)啟動子后,導(dǎo)入矮腳牽牛中,試圖加深花朵的紫顏色,結(jié)果沒看到期待中的深紫色花朵,多數(shù)花成了花斑的甚至白

37、的。Jorgensen將這種現(xiàn)象命名為共抑制(cosuppression),因為導(dǎo)入的基因和其相似的內(nèi)源基因同時都被抑制。開始這被認(rèn)為是矮牽牛特有的怪現(xiàn)象,后來發(fā)現(xiàn)在其他許多植物中,甚至在真菌中也有類似的現(xiàn)象。,88,89,1998年被解開———華盛頓卡耐基研究院的Andrew Fire和馬薩諸塞大學(xué)癌癥中心的Craig Mello首次將雙鏈dsRNA能夠高效地特異性阻斷同源基因的表達(dá)。 實驗表明在線蟲中注入雙鏈ＲＮＡ不單可