流式細(xì)胞分析在臨床血液學(xué)中的應(yīng)用

1、流式細(xì)胞分析在臨床血液學(xué)中的應(yīng)用西南醫(yī)院檢驗(yàn)科 黃君富,1、白血病免疫分型,FAB主要依據(jù)形態(tài)學(xué)和細(xì)胞化學(xué)進(jìn)行分型。MIC方案在FAB方案基礎(chǔ)上結(jié)合了免疫學(xué)和細(xì)胞遺傳學(xué)。（M：形態(tài)學(xué) I：免疫學(xué) C：細(xì)胞遺傳學(xué)）,免疫分型與FAB的關(guān)系,FAB分型受檢查者的主觀因素影響大，符合率有一定限制。免疫標(biāo)志能夠提供正常細(xì)胞在演變成惡性腫瘤過(guò)程中細(xì)胞基因及抗原標(biāo)志發(fā)生變化的信息，而這種變化常常是細(xì)微的，以至于常規(guī)FAB方法不能分辨。

2、免疫分型是MIC的重要組成部分，它是對(duì)FAB分型的補(bǔ)充。,屬于同一種FAB型的病例，可能具有不同的免疫表型。免疫表型在AML和ALL上與FAB的不一致并不減低免疫分型在白血病患者的應(yīng)用價(jià)值，相反，免疫表型使我們對(duì)血液腫瘤細(xì)胞的生物學(xué)特征有了更深入和更精確的認(rèn)識(shí)。免疫表型對(duì)腫瘤的診斷、治療策略的制定、預(yù)后判斷及腫瘤發(fā)病機(jī)制的研究都具有重要作用。,免疫分型的兩個(gè)階段,根據(jù)白血病細(xì)胞表達(dá)的系列相關(guān)抗原，確定其系列來(lái)源。如：淋系T/B、粒單

3、系、紅系、巨核系等。根據(jù)白血病細(xì)胞表達(dá)的系列分化其相關(guān)抗原進(jìn)一步分型。如：早前B，前B，普通B…,急性白血病的四大免疫類型,單表型急性白血病表達(dá)某一個(gè)系列抗原為主的急性白血病雙表型/雙克隆急性白血病未分化型急性白血病,急性白血病的免疫學(xué)系列分型 類 型 系 列 積 分 B系 T系 粒單系 巨核系

4、紅系1.單表型 純B-ALL >2 0 0 0 0 純T-ALL 0 >2 0 0 0 純AML 0

5、 0 >2 0 0 純AML-M6 0 0 ≦2 ≦2 >2 純AML-M7 0 0 ≦2 >2 ≦2,,,,,急性白血病的免疫學(xué)系列分型 類 型 系 列 積 分

6、 B系 T系 粒單系 巨核系 紅系2.單表型為主 My+B-ALL >2 0 ≦2 0 0 My+T-ALL 0 >2 ≦2 0

7、 0 Ly+AML ≦2 ≦2 >2 >2 >2 T+B-ALL >2 ≦2 0 0 0 注: My+ : 髓系抗原陽(yáng)性;Ly+:淋系抗原陽(yáng)性,,,,,急性白血病的免疫學(xué)系列分型 類 型 系

8、 列 積 分 B系 T系 粒單系 巨核系 紅系3.雙表型/雙克隆型 T/B >2 >2 0 0 0 T/M 0 >2 >2 0 0

9、 B/M >2 0 >2 0 0 4.未分化型 AUL ≦2 ≦2 ≦2 ≦2 ≦2,,,,,B細(xì)胞系A(chǔ)LL的免疫分型,,,,T細(xì)胞系A(chǔ)LL的免疫分型 亞型 CD7 CD2 TdT FAB分型早前T-ALL

10、 + — + L1,L2 T-ALL + + + L1,L2,,,,,免疫分型的價(jià)值,確定ALL的細(xì)胞類型（B細(xì)胞或T細(xì)胞）和ALL的分化階段。鑒定AML的特征。對(duì)形態(tài)學(xué)上未分化的急性白血病有助于鑒定細(xì)胞類型。診斷一些少見類型的白血病。如：M6、M7、M0等。,,診斷雙表型/混合細(xì)胞型急性白血病

11、。鑒別診斷ALL伴有髓系抗原表達(dá)（My+）或AML伴有淋系抗原表達(dá)（Ly+）。鑒別急性白血病與其他造血系統(tǒng)和非造血系統(tǒng)惡性腫瘤。根據(jù)一些特殊的免疫表型特征診斷與某核型異常相關(guān)的亞型。如：M3/t(15;17); M2/t(8;21);M4Eo/inv(16)等。,慢性白血病免疫分型,慢性粒細(xì)胞性白血病主要用于急變期的分型（同急性白血病免疫分型）。慢性淋巴細(xì)胞性白血病除了鑒別是T還是B淋巴細(xì)胞型外，還用于與反應(yīng)性淋巴細(xì)胞增多癥的鑒

12、別，以及與部分淋巴瘤的鑒別診斷。一些少見的白血病如：毛細(xì)胞白血病、漿細(xì)胞白血病、惡性組織細(xì)胞性白血病等的診斷與鑒別診斷。,2、再生障礙性貧血的研究,AA是一組由不同發(fā)病機(jī)制介導(dǎo)的骨髓造血功能障礙綜合征，其發(fā)病機(jī)制復(fù)雜，目前尚未完全明了，但越來(lái)越多的臨床和實(shí)驗(yàn)證據(jù)表明，免疫介導(dǎo)的造血抑制AA最常見的病理機(jī)制之一。而且，具有免疫表型異常（如：CD4/CD8倒置，CD8+、活化T細(xì)胞或TCRγδ異常增高等）的患者，臨床表現(xiàn)相對(duì)嚴(yán)重，但免疫抑

13、制治療相對(duì)有較好的療效。,常用的淋巴細(xì)胞表面標(biāo)志物,淋巴細(xì)胞亞群T細(xì)胞： CD3+ 、TCRγ/δ CD4+ (Th/Ti) CD8+ (Ts/Tc)B細(xì)胞： CD19+NK細(xì)胞： CD3- CD16+ CD56+,淋巴細(xì)胞亞群細(xì)分：T細(xì)胞：Ts：CD8+ CD28- Tc：CD8+ CD28+

14、 Th：CD4+ CD29+ Ti：CD4+ CD45RA+B細(xì)胞：B1：CD5+ CD19- B2：CD5 + CD19+,活化淋巴細(xì)胞亞群：活化總T細(xì)胞： CD3+ /HLA—DR+靜止總T細(xì)胞： CD3+ /HLA—DR-活化CD4+細(xì)胞：CD4+ /HLA—DR+活化CD8+細(xì)胞：CD8+ /HLA—DR+活化誘導(dǎo)分子： CD69白細(xì)胞介素2低親和力受體： CD2

15、5CD25+ /CD3+：活化T細(xì)胞CD25- /CD3+：靜止T細(xì)胞,根據(jù)T淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子的不同,CD4+: Th1:CD4+IFNr+ Th2:CD4+IL4+ Th0:CD4+IFNr+IL4+ CD8+: Tc1:CD8+IFNr+ Tc2:CD8+IL4+ Tc0:CD8+IFNr+

16、IL4+,Th1細(xì)胞：介導(dǎo)細(xì)胞免疫、細(xì)胞毒性T細(xì)胞的生長(zhǎng)和活化、巨噬細(xì)胞的活化、介導(dǎo)遲發(fā)型過(guò)敏反應(yīng)。其功能亢進(jìn)將導(dǎo)致炎癥慢性遷延，器官特異性自身免疫病，急性排異反應(yīng)和接觸性皮炎等的發(fā)病和免疫病理?yè)p傷。Th2細(xì)胞 ：介導(dǎo)體液免疫，促進(jìn)B細(xì)胞的生長(zhǎng)、活化和分化，是IgG1和IgE類抗體的轉(zhuǎn)換因子，其功能亢進(jìn)將導(dǎo)致特異性過(guò)敏反應(yīng)，參與高IgE綜合癥和嗜酸性粒細(xì)胞增多癥。Th1/Th2細(xì)胞平衡偏移多見于：感染癥、自身免疫病、過(guò)敏癥、排斥反應(yīng)

17、、免疫缺陷、腫瘤惡化等。檢測(cè)Th1/Th2細(xì)胞平衡主要是分析疾病發(fā)生發(fā)展的狀況，為臨床調(diào)整Th1/Th2細(xì)胞平衡偏提供正確的治療依據(jù)。,3、血栓與止血,血小板糖蛋白 血小板質(zhì)膜糖蛋白GPⅠa ：CDw49b GPⅢa： CD61GPⅠb ：CD42b GPⅣ： CD36GPⅠc ：CDw49f GPⅨ： CD42aGPⅡa ：CD29 GPⅡb： CD41GPⅡa'

18、;：CD31 血小板顆粒膜糖蛋白α顆粒：CD62P (GMP140、PADGEM)λ顆粒：溶酶體完整膜糖蛋白 CD63 溶酶體相關(guān)膜糖蛋白-1 LAMP-1 溶酶體相關(guān)膜糖蛋白-2 LAMP-2,,活化血小板檢測(cè) CD62P， CD63 GPⅡb/Ⅲa復(fù)合物(CD41/61) GPⅣ(CD36) PAC-1 Thrombospondin 血小板內(nèi)鈣離子,遺傳性血小板功能缺陷性疾病

19、診斷 巨血小板綜合癥(BSS)GP Ib-Ⅸ(CD42a/CD42b)缺陷或缺乏 血小板無(wú)力癥(CT)GP Ⅱb/Ⅲa(CD41/61)缺陷或缺乏 貯存池疾病?-SPD下降,4、CD34的絕對(duì)計(jì)數(shù),隨著近年來(lái)外周血造血干細(xì)胞移植病例的日益增多，外周血造血干細(xì)胞的流式定量越來(lái)越成為一個(gè)突出的話題。如何準(zhǔn)確地定量干細(xì)胞數(shù)量，什么是有效的質(zhì)量控制成了各大實(shí)驗(yàn)室的話題。1989年，歐洲人創(chuàng)建了米蘭方案，利用SS與CD34作雙參

20、數(shù)直方圖，計(jì)算CD34陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)；同年，北歐人改進(jìn)了米蘭方案，加入了對(duì)照，稱之米蘭/北歐方案。,1995年，血液病治療及移植國(guó)際聯(lián)合會(huì)(the International Society of Hematotherapy and Graft Engineering，ISHAGE)成立了干細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)(Enumeration)小組，致力于尋求一種簡(jiǎn)單、快速、靈敏的流式細(xì)胞儀檢測(cè)方法去定量外周血中的造血干細(xì)胞數(shù)量。這一方法必須是對(duì)于臨床

21、實(shí)驗(yàn)室中不同的流式細(xì)胞儀都有效，而且在不同的移植中心具有可比性。這一方案即在96年問(wèn)世的ISHAGE方案，至今為止，其他各種方案改進(jìn)均以此方案為基礎(chǔ)。,5、多藥耐藥（MDR）的研究,白血病治療的失敗再很大程度上是由于白血病細(xì)胞對(duì)化療藥物產(chǎn)生了耐藥。因此對(duì)白血病耐藥機(jī)制的研究具有重要的意義。但是耐藥的形成過(guò)程卻很多。主要有幾個(gè)方面：藥物吸收減少、細(xì)胞解毒作用增強(qiáng)、靶分子改變、DNA損傷修復(fù)能力增強(qiáng)、細(xì)胞內(nèi)藥物溢出增多、細(xì)胞凋亡的抑制等。,

22、常見的流式檢測(cè)項(xiàng)目：參與藥物在細(xì)胞內(nèi)外轉(zhuǎn)運(yùn)的蛋白： P-170、MRP、LRP、BCRP、MVP參與細(xì)胞解毒的酶： ALK、GST、GSH、MS抑制細(xì)胞凋亡的蛋白： bcl-2/bax、P53藥物泵的功能檢測(cè)： 羅丹明123（R123）或柔紅霉素,6、陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿(PNH),陣發(fā)性睡眠性血紅蛋白尿(PNH)是由于造血干細(xì)胞發(fā)生體細(xì)胞突變而引起的獲得性溶血性貧血,典

23、型病例有發(fā)作夜間血紅蛋白尿,可伴全血細(xì)胞減少.其溶血是由于紅細(xì)胞膜的獲得性缺陷,對(duì)激活補(bǔ)體異常敏感所致的一種慢性血管內(nèi)溶血。,隨著流式細(xì)胞儀的逐漸推廣，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)CD55、CD59以能從病理上提供直接的證據(jù)而得到廣泛的應(yīng)用。正常人的紅細(xì)胞、網(wǎng)織紅細(xì)胞、粒細(xì)胞、血小板上CD55、CD59表達(dá)完全陽(yáng)性，而PNH患者細(xì)胞則分為三型（依據(jù)CD55、CD59缺乏或減少的程度）,流式細(xì)胞術(shù)在PNH診斷中須注意的事項(xiàng)：1、盡量同時(shí)檢測(cè)紅細(xì)胞和粒

24、細(xì)胞的CD55與CD59的表達(dá)情況。因?yàn)镻NH克隆來(lái)源的紅細(xì)胞在溶血后和輸血后，紅細(xì)胞中PNH克隆細(xì)胞會(huì)減少或檢測(cè)不到，而對(duì)粒細(xì)胞則影響很小。同時(shí)檢測(cè)紅細(xì)胞和粒細(xì)胞CD55和CD59可以區(qū)分小細(xì)胞低色素性貧血和PNH，小細(xì)胞低色素性貧血只有紅細(xì)胞上的CD55和CD59減少，粒細(xì)胞上CD55和CD59正常。2、在檢測(cè)紅細(xì)胞的CD55與CD59時(shí)，可以用全血標(biāo)記，但必須稀釋。而在檢測(cè)粒細(xì)胞的CD55與CD59的表達(dá)時(shí)，必須先溶血再標(biāo)記。因

25、為紅細(xì)胞數(shù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于粒細(xì)胞，紅細(xì)胞的存在會(huì)與粒細(xì)胞競(jìng)爭(zhēng)對(duì)CD55與CD59的結(jié)合。,7、多發(fā)性骨髓瘤（MM）,多發(fā)性骨髓瘤是漿細(xì)胞異常增生性疾病。正常漿細(xì)胞為CD38+/CD45dim/-，使用 CD38/CD45雙標(biāo)記檢測(cè)外周血和骨髓標(biāo)本，可以準(zhǔn)確劃定漿細(xì)胞群。通常使用CD38和CD45，結(jié)合輕鏈檢查，對(duì)多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞進(jìn)行分析。另外，正常漿細(xì)胞的表面標(biāo)記為CD19+/CD56-，而多發(fā)性骨髓瘤細(xì)胞通常為CD19-/CD56+。這樣，使

26、用流式細(xì)胞儀對(duì)外周血或骨髓標(biāo)本進(jìn)行多參數(shù)分析，并計(jì)算異常漿細(xì)胞含量，對(duì)于多發(fā)性骨髓瘤的診斷和治療評(píng)估具有重要意義。,8、血液免疫性疾病,自身免疫性溶血性貧血特發(fā)性血小板減少性紫癜（ITP）免疫性粒細(xì)胞減少癥 以上疾病一般檢測(cè)紅細(xì)胞、血小板、粒細(xì)胞相關(guān)的IgG,IgM,IgD,補(bǔ)體C3等，用以鑒別診斷和輔助臨床治療。,9、血液病的其它檢查,(1) 細(xì)胞凋亡的檢查 Fas及FasL Apo 2·7 bc