流式細(xì)胞技術(shù)

1、流式細(xì)胞術(shù) Flow Cytometry,（FCM）,什么是流式細(xì)胞儀,,●流式細(xì)胞儀實(shí)物,BD FACSVantage,BD-Calibur,1. 發(fā)展歷史1934 Moldavan 1973 Steinkamp,一、  概述,2. 定義：對(duì)在高速流動(dòng)的鞘液包括下對(duì)特異熒光標(biāo)記的細(xì)胞、粒子進(jìn)行分析和分選的技術(shù).3. 特點(diǎn)測(cè)量速度快，每秒鐘能測(cè)數(shù)千個(gè)乃至上萬(wàn)個(gè)細(xì)胞可

2、進(jìn)行多參數(shù)測(cè)量在分析的同時(shí)可把具有指定特征的細(xì)胞分離出來(lái)，即分選技術(shù)。,凡是能被熒光素標(biāo)記的細(xì)胞或顆粒都可用流式細(xì)胞儀檢測(cè)。前提這種熒光素能被流式細(xì)胞儀所配置的激光光源激發(fā)在生物檢測(cè)技術(shù)中流式細(xì)胞儀是不可多得的一機(jī)多用的儀器。,4. 應(yīng)用范圍,二、流式細(xì)胞儀的工作原理和基本結(jié)構(gòu),待測(cè)細(xì)胞以單個(gè)細(xì)胞的懸液，經(jīng)特異性熒光染料染色，放入樣品管，吸入流動(dòng)室。流動(dòng)室充滿鞘液，作用：約束樣品在噴嘴中心，防止樣品靠近噴孔壁堵塞噴孔。細(xì)胞排成

3、單列由噴嘴中心噴出，形成細(xì)胞液柱。,液柱與激光束相交，細(xì)胞上的熒光染料被激發(fā)產(chǎn)生熒光。熒光信號(hào)變成電信號(hào)輸出到計(jì)算機(jī)，軟件分析。,,基本結(jié)構(gòu),流動(dòng)室和液流系統(tǒng)；激光源和光學(xué)系統(tǒng)；光電管和檢測(cè)系統(tǒng)；計(jì)算機(jī)和分析系統(tǒng)。,三、 流式細(xì)胞儀可檢測(cè)到的細(xì)胞參數(shù),非熒光信號(hào),顆粒度,,,細(xì)胞大小,前向角散射光（FSC）細(xì)胞相對(duì)大小及其表面積 側(cè)向角散射光（SSC）細(xì)胞顆粒度及細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞器的相對(duì)復(fù)雜性,血液涂片,外周全血細(xì)胞散射光雙參數(shù)點(diǎn)圖

4、,,,,熒光信號(hào),熒光強(qiáng)度（FL）：細(xì)胞上的熒光染料被激光激發(fā)后發(fā)射出的熒光，不同的熒光染料其發(fā)射波長(zhǎng)不同。有熒光標(biāo)記的細(xì)胞與無(wú)熒光標(biāo)記的區(qū)分開來(lái)（陰陽(yáng)）高FL細(xì)胞與低FL細(xì)胞區(qū)分開來(lái)（強(qiáng)弱）一般的流式細(xì)胞儀只裝有一個(gè)激光光源（488nm），可測(cè)出三個(gè)FL，即FL1、FL2、FL3，大型的流式細(xì)胞儀裝有兩個(gè)或三個(gè)激光光源（488nm、633nm和325nm），可測(cè)出6個(gè)FL。,熒光信號(hào)與細(xì)胞特性,熒光染料被激發(fā)而發(fā)射的光信號(hào)。

5、 定量染色 熒光信號(hào)大小 被標(biāo)記組分含量的定量 多熒光標(biāo)記胞內(nèi)多種組分，實(shí)現(xiàn)多參數(shù)測(cè)量,,,,光信號(hào)分離，導(dǎo)向各探測(cè)通道接收并轉(zhuǎn)化為電信號(hào)。,光信號(hào)收集,三 數(shù)據(jù)處理及流式報(bào)告,,,,,,FSC SSC FL1 FL2 FL3,,,,,,對(duì)數(shù) 線性 線性 線

6、性 對(duì)數(shù),脈沖處理，模數(shù)轉(zhuǎn)換,光信號(hào),電信號(hào),,,記錄數(shù)據(jù)，顯示結(jié)果,（面積，峰高，寬度）,流式報(bào)告的圖一般分為四種，即散點(diǎn)圖、直方圖、密度圖和二維等高圖等。最常用的為散點(diǎn)圖和直方圖。幾個(gè)概念：%Gated：陽(yáng)性細(xì)胞百分比。反映細(xì)胞群體中陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量。Mean：平均熒光強(qiáng)度，與被檢測(cè)物質(zhì)的表達(dá)量有關(guān)，在正態(tài)分布時(shí)一般用該值。Geo Mean：幾何平均熒光強(qiáng)度，在陽(yáng)性細(xì)胞為偏態(tài)分布時(shí)一般用該值。,,,,散點(diǎn)圖,密度圖,二

7、維等高圖,直方圖,圖 報(bào)告中常見的幾種流式細(xì)胞圖,,,,圖 Annexin V/PI雙標(biāo)記分析細(xì)胞凋亡和壞死,流式細(xì)胞儀數(shù)據(jù)分析,點(diǎn)圖分析,流式細(xì)胞儀數(shù)據(jù)分析,直方圖分析,圖中100～101（M1）為陰性細(xì)胞，101以上的（M2）為陽(yáng)性細(xì)胞,五、 流式細(xì)胞術(shù)的應(yīng)用,細(xì)胞結(jié)構(gòu)細(xì)胞大小細(xì)胞顆粒度細(xì)胞表面積核漿比例DNA含量與細(xì)胞周期RNA含量蛋白質(zhì)含量……,細(xì)胞功能細(xì)胞表面/胞漿/核的特異性抗原細(xì)胞活性細(xì)胞內(nèi)/外的

8、細(xì)胞因子激素結(jié)合位點(diǎn)、細(xì)胞受體蛋白磷酸化pH值鈣離子濃度細(xì)胞膜電位、線粒體膜電位 ……,一） 細(xì)胞DNA含量檢測(cè),細(xì)胞固定后用PI （Propidium iodide碘化丙啶），染色，因?yàn)镻I特異性結(jié)合于細(xì)胞DNA，熒光強(qiáng)度與PI的結(jié)合量呈良好的線性關(guān)系，根據(jù)這個(gè)原理，可測(cè)出細(xì)胞的DNA含量。用于細(xì)胞周期、細(xì)胞倍體以及凋亡的檢測(cè)。,,單參數(shù)直方圖,圖中2N代表G0/G1期細(xì)胞，4N代表G2/M期細(xì)胞，兩者中間代表S期細(xì)胞。

9、這是以2倍體和4倍體細(xì)胞為主的流式DNA圖,DNA細(xì)胞周期分析,細(xì)胞周期,,,,,,,,,,,G2,M,G0,G1,s,200,400,600,800,1000,,,,,,s,DNA分析,DNA含量,細(xì)胞數(shù)量,,2倍體,異倍體,4倍體,腫瘤組織中的各種DNA倍體,含量與凋亡關(guān)系,DNA亞G1峰的檢測(cè)：利用PI染色，檢測(cè)具有亞G1期DNA含量的細(xì)胞比例，代表凋亡細(xì)胞數(shù)。凋亡過(guò)程中，細(xì)胞內(nèi)核酸酶的釋放，將DNA降解，分解成小的片段，在標(biāo)本

10、制備中的固定處理時(shí)，細(xì)胞膜的完整性被破壞，使細(xì)胞內(nèi)降解的DNA片段從細(xì)胞內(nèi)流出，造成總體DNA含量減少，成為亞2倍體。,二）腫瘤診斷與抗腫瘤藥物研究,1. 腫瘤診斷,DNA異倍體的出現(xiàn)是癌變的一個(gè)重要標(biāo)志細(xì)胞的增殖能力的大小也可反映腫瘤的生物學(xué)特征利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行細(xì)胞周期分析和DNA倍性分析，輔助腫瘤診斷，包括監(jiān)測(cè)癌前病變、腫瘤的早期診斷和腫瘤細(xì)胞學(xué)診斷。,2倍體,異倍體,4倍體,腫瘤組織中的各種DNA倍體,2. 凋亡研究,在G0

11、/G1峰前出現(xiàn)一個(gè)亞二倍體峰，即凋亡峰。檢測(cè)調(diào)亡，可進(jìn)行抗腫瘤藥物研究和某些因素對(duì)細(xì)胞的損傷機(jī)理的研究。,Annexin V Assay,,,,圖 Annexin V/PI雙標(biāo)記分析細(xì)胞凋亡和壞死,,,Date acquired: 14-Jan-03File: 7Gy 4hr.001Source: dongboDIPLOID: 100.00 % Dip G0-G1: 73.12 % at 48.16 Dip G2-M:

12、 9.59 % at 96.33 Dip S: 17.29 % G2/G1: 2.00 Dip %CV: 6.04Apoptosis: 13.66 % Mean: 27.48,,圖 FCM測(cè)試細(xì)胞周 期分布和凋亡,根據(jù)凋亡細(xì)胞的特點(diǎn)來(lái)檢測(cè),在形態(tài)上，早期細(xì)胞核固縮，染色體邊集在核膜內(nèi)側(cè)顯新月體形、核碎裂；細(xì)胞漿和細(xì)胞器密度增高、細(xì)胞體積變??；細(xì)胞膜皺折卷曲，但早期細(xì)胞膜的完整性未受到破壞凋亡細(xì)胞的FSC

13、 ？SSC ？細(xì)胞壞死時(shí)，細(xì)胞腫脹，F(xiàn)SC ？，SSC ？,CD3(T細(xì)胞，CD4、CD8))、CD19（B細(xì)胞）、CD16、CD56（NK細(xì)胞），原發(fā)性或繼發(fā)性免疫缺陷病、自身免疫性疾病、淋巴細(xì)胞增殖病、腫瘤療效觀察與預(yù)后判斷、移植免疫檢測(cè)等。,三）淋巴細(xì)胞分類,,,,,,,流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞表型,流式細(xì)胞術(shù)白血病免疫分型是利用熒光素標(biāo)記的單克隆抗體作分子探針，多參數(shù)分析白血病細(xì)胞的免疫表型，了解被測(cè)白血病細(xì)胞所屬細(xì)胞

14、系列及其分化程度。FCM分析白血病免疫表型, 快速、特異、準(zhǔn)確，重復(fù)性好，能區(qū)分細(xì)胞起源、劃分其分化發(fā)育階段等，對(duì)白血病的診斷與分型、治療方案選擇與預(yù)后判斷、發(fā)病機(jī)理研究等有重要價(jià)值。,四）白血病的免疫分型,五） 細(xì)胞內(nèi)蛋白的分析：,細(xì)胞破膜后將細(xì)胞內(nèi)某一蛋白成分進(jìn)行熒光標(biāo)記，用流式細(xì)胞儀進(jìn)行測(cè)量分析，同表型分析一樣，可以測(cè)量出這種陽(yáng)性細(xì)胞的數(shù)量和這種蛋白的相對(duì)含量。熒光探針多為FITC。,熒光信號(hào),使用不同熒光標(biāo)記的單克隆抗體染色，

15、做多色分析熒光信號(hào)的強(qiáng)弱，反映了細(xì)胞抗原的表達(dá)含量,熒光樣本制備,雙色直接染色,端粒（熒光蛋白）,六）細(xì)胞內(nèi)鈣離子測(cè)定1×106/ml的細(xì)胞懸液，加入終濃度為1-5μmol/ml Fluo-3/AM，充分混勻，室溫避光作用60分鐘。以HEPES緩沖的Hank’s平衡鹽溶液洗三次，重懸于0.5ml同樣的溶液，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)。根據(jù)報(bào)告中給出的樣品熒光強(qiáng)度計(jì)算細(xì)胞內(nèi)鈣離子的濃度。,,,FCM檢測(cè)胞內(nèi)鈣離子、膜電位和線粒

16、體功能,M1陰性界限劃分完全是根據(jù)陰性對(duì)照！如下圖：紅色部分代表陰性對(duì)照，即：所檢測(cè)的物質(zhì)在陰性組中的基礎(chǔ)表達(dá)量，可以理解為背景、靜息狀態(tài)下、基礎(chǔ)水平、未受刺激時(shí)等。藍(lán)色部分即陽(yáng)性組，也就是接受刺激后，功能狀態(tài)下、藥物作用后等。,六. 分選：,用熒光探針標(biāo)記的細(xì)胞，可被有效地分離出來(lái)，用于分選的效率較高的儀器國(guó)內(nèi)較少，臺(tái)式機(jī)一般分選速度為每秒鐘300個(gè)細(xì)胞，大型機(jī)分選速度可達(dá)到每秒上萬(wàn)個(gè)細(xì)胞,,,,,,488 nm laser,,-